酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的适应性实验室进化（adaptive laboratory evolution, ALE）增强丁酸耐受性并实现与丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）共培养

《Microbial Cell Factories》：Adaptive laboratory evolution of Saccharomyces cerevisiae enhances butyric acid tolerance and enables co-cultivation with Clostridium tyrobutyricum

　　

研究人员成功应用适应性实验室进化（ALE）提升酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对丁酸的耐受性，使其能够在与丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）共培养中用于同步生产作为酯类前体的乙醇和丁酸。酿酒酵母通过在逐步提升至20 g L-1的丁酸浓度下进行连续传代转移而获得适应。进化后的酵母群体表现出显著增强的丁酸耐受性，并在酸胁迫条件下维持乙醇生产。有趣的是，该进化群体在非胁迫条件下还表现出最大葡萄糖消耗速率和乙醇生产率的增加。研究人员通过比较野生型菌株、中间进化群体与ALE获得的最终进化群体进行全基因组变异分析，结果表明适应过程可能与调控过程、细胞稳态以及膜和细胞壁重塑的变化有关。与产酸菌丁酸梭菌的共培养显示出高效且均衡的底物利用，表明两生物间存在稳定的分工。补料分批培养产出20.31±2.43 g L-1丁酸和28.18±3.37 g L-1乙醇。使用进化酵母时，乙醇浓度较既往研究中野生型菌株实现四倍提升，凸显ALE克服共培养体系局限的潜力。

研究背景方面，当前生物技术工艺面临与成熟化石路线竞争的压力，过程强化（process intensification）倡导高度集成的工艺概念。在既往集成工艺中，酿酒酵母与丁酸梭菌共培养结合酶催化酯化及原位液液萃取可产丁酸乙酯，但酵母对丁酸的低耐受性成为瓶颈：丁酸积累导致胞内酸化与代谢胁迫，迫使工艺采用先酵母后梭菌的延迟接种策略，延长了总时长。为突破该限制，研究人员开展本研究，应用适应性实验室进化（ALE）提升酿酒酵母丁酸耐受性，并将进化菌株回接入共培养体系，以稳定分工、强化过程。论文发表于《Microbial Cell Factories》。

主要关键技术方法包括：以DSMZ保藏的酿酒酵母DSM 3799为亲本、丁酸梭菌DSM 2637为共培养伙伴，构建逐步升压（5至20 g L^-1、每级+1 g L^-1、24 h传代）的好氧摇瓶ALE体系并获得BA5–BA20群体；对野生型、中间群体BA9与终末群体BA20进行Illumina全基因组测序，以亲本重新组装基因组为参照做种群水平SNP与结构变异动态频率分析，并借g:Profiler做GO富集；在1 L生物反应器pH控6.0、37°C下以MP2opt合成培养基行补料分批共培养（先接酵母20 min后接梭菌）；HPLC-RI定量糖、乙醇、丁酸及副产物。样本队列即上述保藏株经ALE获得的演化种群与野生型对照。

研究结果部分，“耐酸酵母的获得”显示，ALE在约25代、持续高压下推进，SL9出现生长陡降但BA9时段乙醇时空产率翻倍至0.77 g L^-1 h^-1，BA7–BA20在10 g L^-1丁酸下乙醇生产率显著优于野生型（p<0.05）；终末BA20在15 g L^-1丁酸下乙醇浓度6.25 g L^-1约为野生型3.04 g L^-1的两倍，且无酸时最大葡萄糖消耗速率与乙醇P_max亦升高，表型在无选择压传代后稳定（24 h产率0.95对比原0.92 g L^-1 h^-1）。“ALE期间遗传改变分析”表明，BA9→BA20中固定或近固定的非同义SNP与启动子结构变异富集于质膜/液泡转运（PMA1、PMA2、PDR12、VMA4/5/6/10/16、TRK1）、Clathrin内吞、UDP-糖基转移、Hsp伴侣与泛素-蛋白酶体、脂质与细胞壁重塑及转录调控，印证适应关联离子稳态、质子外排、膜透性下降与蛋白稳态。“进化酵母整合入共培养”显示，补料分批中酵母先建厌氧环境后接梭菌，乳酸初期产生后被重吸收转丁酸；BA20使乙醇在丁酸升至约15 g L^-1仍维持，终体积算丁酸20.31±2.43 g L^-1、乙醇28.18±3.37 g L^-1，总葡萄糖转化产率0.43 g g^-1（野生型对照0.35），乙醇较既往同时接种野生型工艺增四倍，甘油达13.01 g L^-1但与野生型共培养相当而非ALE代价。

讨论部分总结：本研究在代次有限（约25代）但压力连续的ALE下，适应由存活筛选而非复制错误主导，BA9可作为生理转折窗口；酸胁迫下野生型与BA20均上调糖酵解比速率以供能质子泵，而BA20无酸时亦提速，说明耐受与基础产能共选。基因组候选变异指向弱酸被动扩散后Pma1/V-ATPase（VMA）质子隔离、TRK1钾协同、ABC外排、Hsp蛋白稳态及β-葡聚糖/脂质膜改造等已知乙酸-丁酸共享机制，但种群测序仅示关联非因果，需克隆分离验证。共培养中酵母耗氧替外部厌氧化、双菌分工（酵母约48%葡萄糖流向乙醇、梭菌约37%流向丁酸）使单罐前体浓度更高，利于后续酶法酯化平衡右移，相较双罐中间混合稀释方案更契合过程强化。

结论部分原文翻译：本研究中，ALE成功应用于增强酿酒酵母对丁酸的耐受性，使其得以在与丁酸梭菌共培养中应用。进化酵母群体BA20表现出显著改善的酸耐受性，且在无酸胁迫下亦呈现生产率提升。基因组测序表明适应关联调控网络、细胞稳态、蛋白稳态及膜与细胞壁重塑的改变。将适应酵母整合入共培养可在单一反应体系内同步生产乙醇与丁酸，展现稳定共存与高效底物利用。总体而言，本工作证明ALE是克服共培养体系生理局限、启用新型工艺配置并助推过程强化的有力策略。