《Frontiers in Immunology》：Gene-based immunotherapy in osteosarcoma: from oncolytic vectors to engineered immune cells
骨肉瘤一旦发生转移、复发或产生化疗耐药，临床治愈难度极高。手术切除联合多药化疗可改善局限性疾病的预后，但高风险患者的生存获益已陷入平台期，推动免疫治疗领域的研究热度回升。然而免疫检查点阻断在未筛选的骨肉瘤患者中疗效有限：SARC028研究中，22例接受帕博利珠单抗治疗的骨肉瘤患者仅观察到1例客观缓解。该有限应答与肿瘤抗原异质性、免疫抑制性髓系细胞群富集、细胞毒性淋巴细胞浸润不足、基质相关免疫排斥及转移性免疫适应等特征密切相关。基因免疫治疗提供了互补策略：当内源性免疫启动不足时，此类技术可通过促进溶瘤抗原释放、局部细胞因子或趋化因子表达、工程化免疫细胞识别或非病毒免疫调节载荷递送，启动、重塑或放大抗肿瘤免疫应答。本文围绕溶瘤载体、细胞因子武装载体、CAR-T与CAR-NK细胞、TCR或新抗原导向策略及非病毒基因递送系统展开论述，探讨其重塑骨肉瘤免疫微环境的潜在路径，同时分析儿科及青少年患者中的联合策略与转化挑战。除汇总平台层面证据外，本文明确区分骨肉瘤直接研究证据与其他瘤种外推证据，识别各平台核心未解决的科学问题，并梳理当前骨肉瘤特异性临床试验格局，以阐明上述策略的转化成熟度。
1 Introduction
骨肉瘤是儿童及青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，尽管肿瘤生物学研究不断进展，但其临床获益仍十分有限。手术切除联合多药化疗可治愈部分局限性病变患者，但合并肺转移、复发、不可切除病灶或化疗耐药的患者预后极差。以甲氨蝶呤、多柔比星、顺铂为核心的标准多药化疗方案三十余年来未发生显著变革，在儿童及青少年群体中伴随严重的急性与长期毒性，且对微转移灶进展为显性耐药后几乎无额外获益，这一治疗停滞现状为开发机制迥异的基因免疫治疗提供了现实依据。现有综述仍将骨肉瘤描述为治疗进入平台期的疾病，强化细胞毒性治疗难以解决耐药或播散性骨肉瘤的核心问题，这一临床瓶颈推动了免疫治疗研究，但迄今临床活性有限。SARC028研究中，40例可评估疗效的骨肉瘤患者可评估病例中，仅1例达到客观缓解，不足以支持未筛选人群应用免疫检查点阻断治疗。这并非提示骨肉瘤缺乏免疫学相关性，而是表明该病常缺乏标准检查点治疗所需的免疫条件：预激活效应T细胞不足、髓系抑制过度、抗肿瘤免疫应答协调缺陷。
在此背景下，基因免疫治疗应被理解为免疫微环境重编程策略。本文按各平台针对的骨肉瘤屏障进行分类讨论：溶瘤载体可克服抗原释放不足与天然免疫感知缺陷；细胞因子或趋化因子武装载体可增强局部免疫启动与效应细胞招募；工程化免疫细胞可强化抗原识别，但需克服 trafficking、持久性、耗竭及抗原逃逸问题；非病毒系统可向肿瘤、免疫、间质或转移灶递送瞬时载荷。由于多数平台的机制理论基础源于黑色素瘤、胶质瘤或成人癌种，本文明确区分骨肉瘤直接证据与其他瘤种外推证据，并在全文中指出指导未来骨肉瘤定向研究的核心未解问题。本综述纳入英文原创临床研究、骨肉瘤特异性临床前研究及比较性犬骨肉瘤模型，近期综述主要用于识别平台类别与未解决转化问题；在无骨肉瘤特异性数据时选择性纳入更广泛的肉瘤或实体瘤研究，并标注为外推证据而非疾病特异性验证。文献检索截止至2026年7月。
2 Immune resistance in osteosarcoma and the rationale for gene-based therapy
基因免疫治疗的合理性根植于骨肉瘤本身的免疫表型。本节证据直接来源于人或犬骨肉瘤标本，而非其他瘤种外推，因此提供了最具疾病特异性的理论依据。单细胞RNA图谱分析显示，晚期骨肉瘤存在显著的瘤内异质性、抗原呈递可变及以肿瘤相关巨噬细胞、破骨细胞为主的免疫抑制性细胞程序。多组学分析进一步鉴定出预后异质性的骨肉瘤亚型，支持“骨肉瘤并非均为免疫冷肿瘤，多表现为免疫排斥表型”的观点：免疫 cells存在于肿瘤组织中，但与恶性细胞功能隔离而非真正缺失。髓系生物学尤为关键，肿瘤相关巨噬细胞、单核细胞来源群体及髓源性抑制细胞可限制T细胞启动与效应功能。新辅助化疗虽可重塑免疫 landscape，但无法可靠将所有病灶转化为炎性、检查点治疗敏感的肿瘤状态。比较性犬类研究显示，氯沙坦联合多靶点激酶抑制剂toceranib通过阻断单核细胞招募，为转移性骨肉瘤带来显著临床获益，为靶向髓系环路提供了转化证据。
传统免疫治疗还受限于其他屏障：骨肉瘤相关抗原异质性强且表达水平低；细胞毒性T细胞难以穿透致密骨样组织矿化区域；抑制性细胞因子与异常血管生成限制NK细胞活性；肺转移灶可形成与原发骨病灶截然不同的免疫微环境。因此单药PD-1阻断可能因缺乏足够活跃的内源性免疫应答而无法发挥疗效。基因策略则可构建治疗应答所需的免疫条件：溶瘤载体促进肿瘤抗原释放与天然免疫感知；武装载体递送全身给药毒性过高或半衰期过短的载荷；工程化细胞重定向特异性靶标识别。核心问题并非基因治疗能否单独杀伤骨肉瘤细胞，而在于其能否将耐药病灶转化为免疫应答性微环境。当前关键知识缺口在于，尚无前瞻性验证的无创标志物可区分免疫排斥、免疫荒漠及短暂炎性骨肉瘤病灶，若无活检则无法在实践判定该状态，限制了基因免疫治疗的理性 upfront选择。
3 Oncolytic vectors as in situ immune activators
溶瘤载体在骨肉瘤中具有双重作用：除直接裂解肿瘤细胞外，其核心价值在于将肿瘤组织转化为原位免疫激活位点。溶瘤过程释放肿瘤抗原、损伤相关分子模式、病毒病原相关信号及炎性细胞因子，可促进树突状细胞激活、I型干扰素信号通路、交叉呈递及T、NK细胞活化，这种疫苗样功能对免疫耐药肿瘤可能比单时间点感染细胞比例更为重要。
骨肉瘤特异性证据仍有限但具生物学启示。VCN-01溶瘤腺病毒编码透明质酸酶以降解细胞外基质，克服限制常规病毒渗透的基质屏障，在儿童骨肉瘤模型中显示出显著抗肿瘤活性。后续研究显示，装载4-1BBL的溶瘤腺病毒可在儿童骨肉瘤模型中诱导抗肿瘤效应与持久免疫记忆，提示载荷设计的重要性超越溶瘤骨架本身。犬类自然发生骨肉瘤模型证实，新辅助系统性水疱性口炎病毒给药安全且可能延长长期生存，为更接近人类骨肉瘤生物学的系统性溶瘤递送提供了比较模型。抗PD-1单域抗体武装溶瘤病毒的体外骨肉瘤研究则证明，载体可被设计为携带局部递送的检查点阻断药物。
临床层面，骨肉瘤特异性溶瘤病毒治疗证据仍局限于早期可行性研究：针对复发颅外实体瘤（含骨肉瘤）的儿童鞘内HSV1716 I期试验证实了安全性与病毒复制证据，但未观察到客观肿瘤缓解；儿童肿瘤协作组的静脉注射呼肠孤病毒I期试验中，包括多种肉瘤亚型的安全性良好，但同样无客观肿瘤消退。尚无骨肉瘤限制性溶瘤病毒试验产出随机或生物标志物分层疗效数据，也未报告骨肉瘤特异性疗效终点。主要溶瘤病毒平台的对比显示：腺病毒具有大转基因容量，可装载基质降解酶克服骨样屏障，但普遍存在预存中和免疫，主要局限于局部递送；单纯疱疹病毒HSV-1（如HSV1716）载荷容量极大，儿童瘤内注射安全性数据丰富，但局部给药为主，致密基质穿透有限，存在理论上的潜伏再激活风险；痘苗病毒载荷容量超过25 kb，可系统性给药，快速复制并诱导强天然免疫激活，但既往疫苗接种史影响免疫应答，武装后存在系统性细胞因子毒性风险；水疱性口炎病毒血清流行率低，大动物研究证实系统性给药耐受性良好，但野生毒株存在神经毒性风险，需通过干扰素增敏工程改造缓解。
武装载体进一步拓展了应用空间。IL-12武装痘苗病毒证明，细胞因子载荷可实现局部免疫激活增强同时降低系统性毒性。骨肉瘤特异性临床前证据还包括SIRPα-Fc武装痘苗病毒，其在免疫 competent小鼠模型中延缓肿瘤进展并提高生存率。GM-CSF表达的talimogene laherparepvec证实局部溶瘤免疫治疗的临床活性，但黑色素瘤证据不能直接外推至骨肉瘤。对于骨肉瘤，载荷选择需匹配主导性免疫缺陷：效应细胞无法入瘤时趋化因子更具价值，而树突状细胞启动与激活不足时IL-12或共刺激配体更为关键。溶瘤载体在骨肉瘤中的最合理定位并非 standalone溶瘤 agent，而是作为可编程局部免疫激活剂，为后续检查点阻断或细胞治疗提供生物学基础。当前关键知识缺口在于，除小型单臂儿童安全性试验外，尚无溶瘤载体针对明确骨肉瘤生物标志物假说（如基线髓系浸润或抗病毒免疫状态）开展测试，因此无法确定最可能获益的人群。
4 Engineered immune cells for osteosarcoma
工程化免疫细胞针对的是另一局限：内源性淋巴细胞对骨肉瘤的识别强度不足，且难以在抑制性微环境中持久存活。CAR-T细胞是最成熟的平台。首个HER2特异性CAR-T细胞治疗HER2阳性肉瘤的临床试验纳入19例患者（含骨肉瘤病例），剂量递增至1×108 cells/m2，治疗可行且耐受性良好，无剂量限制性毒性，17例可评估患者中4例实现12周至14个月的疾病稳定，但RECIST标准下未观察到客观缓解。前期研究已证明T细胞基因修饰可克服骨肉瘤低抗原密度问题，为弱靶标表达肿瘤提供了概念验证。
靶标选择也在不断演进。IL11Rα导向的T细胞在临床前模型中诱导已建立的骨肉瘤肺转移消退。NKG2D-CAR记忆T细胞通过识别骨肉瘤细胞表达的应激配体，可部分降低对传统单一肿瘤抗原的依赖。GD2导向CAR-T细胞联合低剂量多柔比星显示出临床前协同效应，提示适当剂量的化疗可在不增加毒性的前提下增敏肿瘤细胞对工程化免疫治疗的响应。B7-H3因在儿童实体瘤中广泛表达受到重点关注，临床前研究证实其对儿童实体瘤及脑肿瘤具有强效活性，后续体外与体内实验进一步验证了其在骨肉瘤中的特异性活性。
核心局限在于，更强的抗原识别并不必然转化为骨肉瘤临床疗效。抗原异质性与表达水平波动可导致逃逸；trafficking不良阻碍效应细胞抵达肿瘤；T细胞耗竭、抑制性髓系细胞、缺氧及致密细胞外基质可降低持久性与细胞毒性。这些屏障在原发矿化病灶与多灶性肺转移之间存在差异，系统性trafficking与病灶间免疫异质性尤为重要。最新工程策略已超越单纯抗原特异性杀伤：重定向B7-H3 CAR-T细胞至IL-8梯度可改善归巢与抗肿瘤活性；靶向骨肉瘤表达的趋化因子亦可获得类似结果，将设计目标从单一抗原识别转向协调归巢、持久性及局部抑制抵抗。B7-H3前景良好，但并非严格肿瘤限制性抗原，正常组织表达与患者间差异要求严格的安全性评估，因此自杀开关、瞬时mRNA表达及可调式或逻辑门控受体成为靶标选择性不完善时的重要安全保障。
CAR-NK细胞与 innate样工程化细胞可提供互补优势。NK细胞可识别应激信号，安全性谱可能不同，但持久性仍是挑战。GD2 CAR-T扩增的免疫决定因素研究揭示了宿主与肿瘤背景如何塑造细胞治疗行为，这是临床前模型未能充分预测的。工程化γδ T细胞递送载荷在临床前骨肉瘤模型中显示出增强的细胞毒性、持久性与疗效。mRNA工程化EphA2 CAR-NK细胞在包括骨肉瘤在内的儿童肉瘤模型中表现出临床前活性，支持瞬时非整合工程作为灵活策略。针对儿童实体瘤的NK细胞综述强调，迁移、持久性与制备仍是主要障碍。
TCR-T与新抗原导向策略可拓展靶标空间至表面抗原以外，但目前对多数骨肉瘤患者而言仍处于探索阶段，尚未成为近期临床选项。其可行性依赖HLA限制性、靶肽可靠呈递、共享而非完全私有新抗原鉴定，以及原发与转移灶间的克隆保守性。在抗原呈递变异的遗传异质性肿瘤中，个体化新抗原发现对于进展期儿科或青少年患者而言耗时且资源密集。这些限制并非否定TCR策略的价值，而是提示在当前转化序列中，此类策略应晚于更成熟的表面靶标与递送策略开展。
骨肉瘤CAR-T治疗耐药应理解为多个独立且部分重叠的机制，而非单一失败模式。抗原层面耐药包括病灶间及病灶内靶标表达 pre-existing异质性，以及CAR-T选择性压力下的获得性抗原丢失或下调。Trafficking层面耐药源于致密骨样与矿化基质穿透困难，以及缺乏肿瘤导向趋化因子梯度，趋化因子受体工程可部分解决这一问题。微环境层面耐药包括髓源性抑制细胞与肿瘤相关巨噬细胞局部抑制T细胞功能、TGF-β及其他免疫抑制细胞因子、缺氧及肿瘤床内营养竞争。细胞内在耐药包括反复抗原刺激后的进行性T细胞耗竭与持久性丧失。由于这些机制作用于不同层面，单一工程改造难以完全解决，未来骨肉瘤试验应通过配对治疗前后活检进行机制表征，而非假设患者间耐药模式一致。
双靶点与多靶点CAR策略是针对抗原层面耐药的合理对策。双特异性或串联CAR同时识别两个骨肉瘤相关抗原（如B7-H3联合GD2或HER2），可降低完全抗原逃逸概率——肿瘤细胞需同时丢失两个靶标而非一个才能逃逸识别；AND门控或OR门控逻辑控制CAR在任一抗原单独肿瘤限制性不足时，可进一步提升肿瘤选择性。这些潜在优势需权衡构建复杂性、单靶标亲和力可能低于单特异性CAR，以及更严苛的制备与放行检测。对于骨肉瘤这类无单一表面抗原兼具高限制性与普遍表达特征的肿瘤，双靶向在概念上具有吸引力，但迄今主要在临床前模型或其他实体瘤中测试，尚缺乏骨肉瘤特异性单靶与双靶构建体的前瞻性头对头比较。
5 Gene delivery systems and immune-modulating payloads
基因免疫治疗的效果取决于递送系统而非仅载荷本身。病毒系统在载荷容量、嗜性、表达时长、免疫原性及整合风险上存在差异。非病毒系统包括脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、外泌体递送、水凝胶及局部生物材料，设计灵活性更高，但常面临生物分布、转染效率及组织穿透的挑战。病毒与非病毒系统的对比显示：病毒载体载荷容量依平台而异（约4 kb至>30 kb），表达时长高度依赖载体类型（非整合或溶瘤载体多为瞬时，整合载体可能持久），免疫原性较强（存在抗载体免疫与 pre-existing中和抗体），整合风险仅见于逆转录/慢病毒等整合载体，制备复杂且成本高，骨/肿瘤组织穿透受限于致密骨样与矿化基质，重复给药受首次给药后抗载体中和免疫限制，监管路径成熟（已有T-VEC等获批产品）。非病毒系统通常适用于mRNA、siRNA/寡核苷酸及质粒DNA递送，表达多为瞬时（无需永久整合时更具优势），免疫原性较低但仍可触发天然免疫应答，整合风险极低，制备可能更标准化、可规模化但冷链物流与质量控制要求高，骨组织穿透同样受限（纳米颗粒尺寸与表面化学性质显著影响穿透），重复给药可行性更高（中和免疫顾虑少），监管路径成熟度较低（mRNA-LNP平台受益于COVID-19疫苗经验）。
原发骨病灶与肺转移的屏障存在显著差异，递送策略需匹配对应特征。原发骨病灶中，致密细胞外基质、稀疏异常血管及低间质液流限制病毒颗粒扩散与纳米颗粒穿透，因此局部或瘤内注射、基质降解酶武装（如透明质酸酶表达腺病毒）及影像引导注射对骨局限性疾病更为关键，优于系统性递送。相比之下，致死性骨肉瘤复发的主要部位——肺微转移灶通常体积小、多灶且血管化程度高于原发灶，适合系统性静脉给药，但同时呈现病灶间异质性强、免疫微环境快速演变的特征，且系统性载体或纳米颗粒暴露带来肺毒性及肝、脾脱靶分布的独特风险。目前极少有研究在同一骨肉瘤模型中直接比较原发骨与肺转移灶的递送性能，这是理性载体选择的重要缺口。
骨肉瘤中这些递送限制尤为突出。原发骨肿瘤包含骨样组织、矿化基质、异常血管及坏死区，肺转移则可形成多个空间分散的沉积灶。靶向携带细胞周期素G1杀伤性构建体的逆转录病毒载体Rexin-G在化疗耐药肉瘤与骨肉瘤患者中的静脉给药试验，是该疾病背景下系统性基因递送的早期临床范例，但其载荷为杀伤性而非直接免疫调节性。近期非病毒研究探索了可生物降解二氧化碳衍生载体用于骨肉瘤基因递送，以及结合NIR-II光热治疗的多功能纳米平台。纳米颗粒递送miRNA调控骨肉瘤生物学已有综述，但免疫重编程应用成熟度远低于肿瘤 intrinsic应用。
潜在载荷范围广泛，但免疫导向综述需区分肿瘤 intrinsic递送与免疫调节递送。肿瘤细胞导向的RNA干扰、miRNA替换或细胞毒性基因方法可直接损伤恶性细胞，而细胞因子、趋化因子、检查点阻断分子、共刺激配体、肿瘤抗原、STING或TLR激动剂及用于细胞工程的瞬时mRNA构建体旨在改变免疫区室或间质微环境。mRNA非病毒递送与脂质纳米颗粒的进展使瞬时免疫调节日益可行，尤其适用于无需永久整合的场景。外泌体系统可能具备生物相容性优势，但加载效率、标准化及可规模化制备仍未解决。纳米颗粒介导STING激动剂递送证明，包装可改善肿瘤定位并减少系统性暴露。对于骨肉瘤，需明确靶区：矿化原发灶、微转移肺沉积灶、抑制性髓系微环境及 bulky复发肿瘤可能分别需要不同的载体动力学、免疫载荷及安全控制措施。
6 Combination strategies and translational barriers
骨肉瘤基因免疫治疗的临床试验格局仍以临床前与早期研究为主，相较于更广泛的肉瘤与儿童实体瘤文献，骨肉瘤特异性试验仍稀缺。早期儿童研究已确立颅外实体瘤（含骨肉瘤）瘤内与静脉溶瘤病毒治疗的可行性：影像引导瘤内注射溶瘤单纯疱疹病毒HSV1716的I期试验安全性良好，显示病毒复制与免疫激活证据，但未观察到客观缓解；儿童肿瘤协作组在复发/难治性颅外实体瘤（含多种肉瘤组织学类型）中开展的静脉注射呼肠孤病毒（Reolysin）I期试验同样安全性良好，无客观肿瘤消退。这些试验确立了可行性而非疗效。截至2026年7月19日复查ClinicalTrials.gov注册记录，尚无仅限于骨肉瘤的溶瘤病毒试验产出随机或生物标志物分层疗效数据，也未报告骨肉瘤特异性疗效终点，现有溶瘤病毒证据主要来自包含骨肉瘤的儿科/实体瘤试验或更广泛的实体瘤溶瘤病毒研究。两项重组溶瘤HSV-1 R130治疗晚期或复发/难治性骨与软组织肿瘤的注册记录将骨肉瘤列为符合条件（NCT06171282与NCT05851456），ClinicalTrials.gov当前总体招募状态为“未知”，最后已知状态为“招募中”（分别于2023年12月与2023年4月最后验证），两项研究均非仅限于骨肉瘤，应解读为混合队列研究且注册状态过时，而非确认的积极招募骨肉瘤特异性试验。
相比之下，骨肉瘤定向CAR-T试验正在涌现。FIERCe试验（FOLR1免疫效应细胞治疗晚期骨肉瘤；NCT07227571）正在招募晚期难治性或复发/进展性骨肉瘤患者，测试FH-FOLR1 ST CAR-T细胞。B7-H3导向CAR-T策略包括一项包含骨肉瘤的儿科实体瘤I期试验（NCT04897321）、一项活动但不再招募的复发/难治性儿科实体瘤研究（含骨肉瘤，NCT04483778），以及一项在新诊断高危儿科骨肉瘤MAP化疗后测试巩固性B7-H3 CAR-T细胞的II期研究（NCT07428993）。近期骨肉瘤试验格局系统分析显示，免疫肿瘤学方法现已占新型药物试验的很大比例，超过90%的骨肉瘤试验仍处于I/II期，后期生物标志物分层试验明显匮乏。综上，试验格局证实骨肉瘤基因免疫治疗仍处于建立安全性与生物学概念验证阶段，该领域的核心未满足需求是少数设计良好的机制关联II期试验，而非更多临床前平台。
联合策略的必要性源于骨肉瘤免疫耐药的多因素性。溶瘤载体可提供抗原释放与天然免疫激活，但若新启动的T细胞发生耗竭，仍需检查点阻断。工程化免疫细胞可能需要髓系重编程、血管正常化或趋化因子受体匹配才能抵达肿瘤。当细胞毒性治疗增加抗原释放或增强免疫杀伤敏感性时，基因治疗也可与化疗或放疗联用。联合设计应基于病灶生物学而非经验便利：免疫冷原发灶适合溶瘤或天然免疫激动剂平台；B7-H3高表达但T细胞trafficking不良的转移灶可能需要搭载归巢受体的工程化CAR-T细胞；髓系富集的肺转移微环境可能需要在细胞治疗前开展巨噬细胞或单核细胞调控。给药顺序同样重要：载体先于细胞治疗给药可能增加抗原释放与趋化因子产生，而细胞输注后给予载体可能支持持久性，但也可能增加炎性毒性。
临床转化仍面临挑战。患者群体小，儿科开发需严格安全标准，转移或复发疾病的终点难以标准化。载体中和、插入风险、细胞因子毒性、神经毒性、生产成本、放行检测及监管复杂性均需尽早解决。原发灶与转移灶的异质性意味着单次活检可能无法捕获真正的免疫屏障。现行骨肿瘤指南强调多学科治疗与临床试验入组，尤其针对复发或难治性疾病。生物标志物应具备空间与功能性：靶抗原密度、髓系与淋巴样比值、巨噬细胞密度、干扰素刺激基因表达（作为基线炎症替代指标）、循环标志物（如ctDNA负荷或髓源性抑制细胞频率）可能比单纯PD-L1整体表达更具信息量。试验应包含药效学终点，以证明基因平台是否真正重编程了靶免疫微环境。配对活检、影像引导采样、循环肿瘤DNA动态及免疫细胞图谱有助于区分生物学失败与递送不足——这一区分至关重要：阴性试验可能反映剂量不足、路径错误、瘤内暴露不充分或患者选择不当，而非整个平台类别的失败。然而，多数联合逻辑源于成人实体瘤与黑色素瘤数据，而非骨肉瘤直接验证，在任意序贯策略确立前，仍需在骨肉瘤特异性模型与试验中开展前瞻性验证。
前瞻性患者选择的候选标志物包括诊断活检或转移灶切除标本中检测的肿瘤表面抗原密度（如HER2、GD2、B7-H3、IL11Rα）、基线髓系/淋巴样比值与巨噬细胞密度、作为基线炎症 proxy的干扰素刺激基因表达，以及循环标志物如ctDNA负荷或髓源性抑制细胞频率。然而，尚无标志物在骨肉瘤中得到前瞻性验证的预测性生物标志物，多数当前试验仍入组生物标志物未筛选患者。因此，将治疗前活检与生物标志物评估纳入试验设计应视为近期优先事项，因为基因免疫治疗不太可能为未筛选的骨肉瘤人群带来获益。
制备可行性也是重要的转化壁垒。自体CAR-T与CAR-NK产品需要个体化载体生产、细胞扩增与放行检测，而异体或现货型产品可能改善可扩展性，但引入免疫排斥与持久性有限的顾虑。病毒载体生产同样成本高昂且平台特异，非病毒系统可能更易标准化与规模化，但仍需严格质量控制与冷链基础设施。因此，生产成本与可扩展性应在平台选择早期予以考量，而非仅在临床疗效证实后评估。
7 Conclusion
骨肉瘤基因免疫治疗应被理解为免疫微环境重编程策略。核心挑战不仅在于杀伤骨肉瘤细胞的难度，更在于耐药病灶常伴随抗原异质性、髓系抑制、淋巴细胞迁移障碍、物理基质屏障及转移性免疫适应。基因平台的优势在于可编程性，可同时应对多重屏障。溶瘤载体可作为局部免疫激活剂与载荷载体；工程化T细胞、NK细胞、γδ T细胞及TCR工程化策略可强化识别，但需同步优化迁移、持久性及抑制抵抗能力；非病毒系统可实现可重复、瞬时的免疫调节载荷递送，但其在骨肉瘤中的递送性能需直接验证。未来进展依赖于理性载体选择、载荷设计、空间生物标志物及机制引导的联合治疗。实践中，抗原释放不足的免疫冷病灶更适合溶瘤载体或天然免疫激动剂；B7-H3高表达但T细胞trafficking不良的肿瘤可能需要搭载归巢受体的CAR-T细胞；髓系抑制显著的肺转移灶可能需要在细胞治疗前后联用髓系靶向治疗。临床转化需在儿科与青少年患者中谨慎推进。
下一阶段临床转化应锚定三项优先事项：首先，试验应纳入强制性的治疗前与治疗中活检或微创替代标志物，以空间与功能性生物标志物而非单纯组织学亚型指导患者选择；其次，联合序贯策略（包括载体与细胞治疗的先后次序、与检查点阻断/化疗/髓系靶向药物的联用）应基于明确机制假说开展前瞻性测试，而非经验性尝试；第三，双靶CAR构建体、基质穿透型武装载体及可规模化非病毒递送平台应优先纳入早期骨肉瘤特异性试验，因其直接针对本综述识别的抗原逃逸、基质屏障与制备瓶颈。下一步目标并非简单将基因治疗叠加至现有骨肉瘤治疗方案，而是利用基因平台将免疫耐药病灶转化为临床可管理的免疫微环境。
