整合性单核转录组分析鉴定小细胞肺癌中UBE2C+增殖性肿瘤细胞及免疫-基质调控交互作用

《Frontiers in Immunology》：Integrative single-nucleus transcriptomic analysis identifies UBE2C+ proliferative tumor cells and immune-stromal regulatory crosstalk in small cell lung cancer

　　

背景：小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）是一种侵袭性神经内分泌恶性肿瘤，以快速增殖、早期播散和当前化学免疫疗法的持久获益有限为特征。尽管免疫检查点阻断已适度改善临床结局，但连接恶性细胞状态与肿瘤免疫微环境的调控逻辑仍不完全清楚。本研究应用整合性单核转录组框架，解析SCLC中肿瘤细胞异质性、调控程序及免疫-基质通讯网络。方法：研究人员利用公开可用的原发性和转移性SCLC样本的单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）数据，采用Seurat聚类、inferCNV恶性细胞鉴定、差异表达分析、通路富集、代谢和干性评分、伪时间轨迹重建、CellChat介导的细胞间通讯推断及转录因子（transcription factor, TF）调控模块分析。研究人员优先筛选出一个UBE2C富集的增殖性肿瘤细胞亚群进行功能验证。在DMS114和NCI-H446 SCLC细胞系中实施siRNA介导的UBE2C敲低，随后进行qRT-PCR、CCK-8、集落形成、Transwell迁移及Annexin V/PI凋亡检测。结果：利用snRNA-seq，研究人员鉴定出多种细胞类型，并解析出一个具有显著增殖特征的UBE2C⁺亚群。UBE2C⁺亚群显示强烈的G2/M期富集、升高的有丝分裂和细胞周期程序。伪时间分析将C3 UBE2C⁺肿瘤细胞定位于肿瘤细胞状态演化过程中的一个增殖状态。细胞间通讯分析提示，该亚群可能通过GRN-SORT1和THBS1-CD47/CD36信号轴与巨噬细胞和成纤维细胞相互作用，表明增殖性肿瘤状态与候选通讯轴之间存在潜在联系。转录因子模块分析进一步揭示C3亚群中细胞周期相关调控因子（包括MYBL2、NFYB、E2F2、TGIF1和RXRG）的富集。功能上，UBE2C敲低显著抑制SCLC细胞的增殖、克隆形成和迁移，同时增加凋亡。结论：本研究将UBE2C⁺增殖性肿瘤细胞鉴定为SCLC中一个功能相关的恶性亚群，并将该状态与肿瘤微环境内的免疫-基质通讯网络联系起来。通过整合单核转录组学、调控网络推断、细胞间通讯分析和体外验证，研究结果提名UBE2C为潜在的功能候选调控因子，并为研究SCLC的癌症-免疫调控组提供了一个系统层面的框架。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）是一种高度侵袭性的神经内分泌恶性肿瘤，占所有新发肺癌病例的13%–15%，以快速增殖、早期转移和预后极差为特征。尽管依托泊苷联合铂类化疗的初始反应率超过50%，但患者常在短期内复发并进展为耐药状态，后续治疗选择有限。近年来，免疫检查点抑制剂（如阿替利珠单抗和度伐利尤单抗）联合化疗虽能延长广泛期SCLC患者的总生存期，但总体获益仍相当有限。在靶向治疗方面，针对DLL3、PARP、BCL-2等靶点的药物临床转化效果不佳。因此，SCLC目前面临治疗选择匮乏、耐药机制不清、有效靶向药物和可靠生物标志物短缺等多重挑战。传统整体转录组分析往往掩盖低丰度关键细胞群的贡献和细胞群体的异质性，而单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）技术能以单细胞分辨率精确表征不同细胞状态及其相互作用网络，为深入解析SCLC微环境中的复杂细胞间通讯提供了新工具。然而，目前关于增殖性恶性细胞状态与免疫-基质微环境之间的调控联系仍不明确，特别是特定肿瘤细胞亚群是否作为协调细胞周期进程、代谢适应、转录因子（transcription factor, TF）活性及免疫-基质交互作用的调控节点尚未被阐明。

**研究目的与意义**

为解决上述问题，研究人员对来自原发性和转移性SCLC样本的snRNA-seq数据进行了整合分析，构建了SCLC肿瘤免疫微环境的单核图谱。通过鉴定恶性细胞亚群及其功能特征，研究人员发现了一个以UBE2C高表达为标志的增殖性肿瘤细胞亚群，并揭示了其与免疫-基质细胞的通讯网络。该研究不仅为理解SCLC的肿瘤异质性和微环境调控提供了系统视角，还提名UBE2C为潜在的功能可靶向恶性状态，为后续治疗策略开发奠定了基础。该论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**关键技术与方法**

本研究主要采用以下关键技术方法：基于Seurat的聚类分析进行细胞类型鉴定；利用inferCNV工具进行拷贝数变异（copy number variation, CNV）分析以区分恶性肿瘤细胞与非恶性细胞；通过差异表达分析、基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集以及基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）进行功能注释；使用AUCell算法评估代谢通路活性和细胞干性；利用Monocle和Slingshot进行伪时间轨迹重建；通过CellChat推断细胞间通讯；采用SCENIC进行转录因子调控模块分析。样本队列来源为公开的GEO数据库（GSE303152），包含原发性和转移性SCLC样本的snRNA-seq数据。此外，在DMS114和NCI-H446 SCLC细胞系中通过siRNA介导的UBE2C敲低进行体外功能验证。

**研究结果**

**3.1 小细胞肺癌的单细胞景观**
通过对snRNA-seq数据进行处理和质量控制，研究人员获得高质量细胞，并基于标志基因将其分为8种主要细胞类型：上皮细胞（epithelial cells, EPCs）、T/NK细胞、单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞、B细胞/浆细胞、内皮细胞（endothelial cells, ECs）、中性粒细胞和肝细胞。UMAP降维显示EPCs分布更广。细胞周期分析表明，EPCs在G2M和S期比例显著高于其他细胞，提示其增殖活跃。在原发性样本中EPCs比例较高，而在转移性样本中EPCs比例较低，肝细胞仅存在于转移样本中。词云图显示EPCs与“细胞周期”、“有丝分裂”等生物学过程密切相关。干性分析显示EC和EPC具有高干性。代谢通路分析表明EPCs主要富集氧化磷酸化、核苷酸代谢和脂肪酸合成通路，提示其具有强增殖潜力。

**3.2 小细胞肺癌肿瘤细胞亚群的可视化**
通过inferCNV分析，研究人员鉴定出EPCs携带显著染色体拷贝数变异，并据此将其分为4个肿瘤细胞亚群（C0–C3）。命名基因IFI27、NCAM1、CCER2和UBE2C在各亚群中表达分布差异显著，其中UBE2C几乎仅在C3亚群中表达。细胞周期分析显示，UBE2C表达从G1期到S期先升高后降低，提示C3亚群可能具有更强增殖能力。在转移性样本中，NCAM1、CCER2和UBE2C表达高于原发性样本。C3亚群在G2M期评分更高，与SCLC高度增殖和侵袭特征一致。

**3.3 四种肿瘤细胞亚群的不同功能与细胞类型特征**
Ro/e偏好分析显示，C0 IFI27⁺肿瘤细胞（tumor cells, TCs）在原发性样本中偏好，C1和C2亚群偏好转移性样本，C3 UBE2C⁺ TCs在G2M期偏好。差异表达基因分析确认了各亚群的异质性，KEGG富集分析显示C3亚群主要参与细胞周期相关通路。GSEA分析表明C3亚群高表达细胞分裂相关通路，词云图进一步显示其富集有丝分裂相关基因（如AURKB、PLK1），证实其增殖活跃、促进肿瘤生长。

**3.4 四种亚群的代谢与干性特征**
代谢通路分析显示，C3 UBE2C⁺ TCs在氧化磷酸化、糖酵解/糖异生和谷胱甘肽代谢通路中活性较高。与原发性样本相比，转移性样本中氧化磷酸化活性较低，而谷胱甘肽代谢水平相似，提示转移过程伴随代谢重编程。干性分析显示C3亚群干性低于C2亚群，但转移性样本干性评分高于原发性样本。干性基因表达分析显示，EZH2在C3亚群中表达最高，SOX2在C2亚群中最高，TWIST1在C1亚群中最高；转移性样本中EZH2和SOX2表达降低，而TWIST1表达升高。

**3.5 伪时间分析揭示肿瘤细胞亚群的发育与分化特征**
Monocle伪时间排序显示，C1 NCAM1⁺ TCs主要分布于早期伪时间，C0 IFI27⁺ TCs和C3 UBE2C⁺ TCs分布于整个轨迹，C2 CCER2⁺ TCs集中于晚期。Slingshot分析重建了两个谱系：谱系1为C3→C0→C1；谱系2为C3→C0→C2。C3亚群在细胞分化谱系中占据关键位置，可能参与肿瘤细胞状态转变。

**3.6 细胞间通讯分析鉴定与UBE2C⁺ TCs相关的GRN和THBS信号**
CellChat分析显示，C3 UBE2C⁺ TCs作为信号发送者时与C1亚群、B/浆细胞和内皮细胞通讯活跃；作为接收者时与C0、C1亚群和成纤维细胞通讯活跃。在GRN信号通路中，单核细胞/巨噬细胞通过高表达GRN作为信号发送者，C3 UBE2C⁺ TCs通过SORT1受体作为主要接收者。在THBS信号通路中，C3 UBE2C⁺ TCs同时作为接收者和调节者，成纤维细胞作为信号发送者。层次网络分析推断C3 UBE2C⁺ TCs与单核细胞/巨噬细胞之间存在GRN-SORT1通讯，与成纤维细胞之间存在THBS1-CD47通讯，CD36可能作为辅助受体。

**3.7 转录因子调控模块的鉴定与分析**
基于连接特异性指数（connection specificity index, CSI）矩阵，研究人员将细胞分为三个TF模块（M1–M3）。C3亚群在M1模块中表达水平较高。热图显示C3亚群中表达最高的5个TF为MYBL2、NFYB、E2F2、TGIF1和RXRG，其中E2F2和TGIF1表达显著高于其他亚群，提示C3亚群具有独特的TF调控网络。

**3.8 UBE2C敲低抑制SCLC细胞的增殖和迁移表型**
在DMS114和NCI-H446 SCLC细胞系中，siRNA敲低UBE2C后，qRT-PCR确认mRNA有效降低。CCK-8实验显示UBE2C敲低后细胞短期增殖能力显著下降。集落形成实验显示长期克隆生长能力受抑。Transwell迁移实验表明迁移能力显著降低。Annexin V/PI流式细胞术检测显示凋亡细胞比例显著增加。这些结果证实UBE2C在SCLC细胞中促进增殖、克隆形成、迁移并抑制凋亡，支持其作为潜在致癌驱动因子的作用。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究通过整合snRNA-seq系统生物学框架，鉴定出C3 UBE2C⁺ TCs作为一个增殖性亚群，具有G2/M期富集、有丝分裂基因表达、代谢激活及伪时间轨迹中的过渡位置特征。该亚群不仅由肿瘤内在增殖程序定义，还与巨噬细胞和成纤维细胞相关的通讯网络（GRN-SORT1和THBS1-CD47/CD36）相连。代谢特征显示氧化磷酸化和谷胱甘肽代谢增强，提示该亚群依赖线粒体氧化代谢维持能量供应，同时通过抗氧化防御应对增殖相关氧化应激。伪时间分析表明C3亚群位于谱系发育早期至中期，UBE2C作为E2泛素连接酶通过与后期促进复合体/细胞周期体（APC/C）协同作用，调控细胞周期蛋白降解，驱动G2/M期转换，并可能通过Akt-mTOR信号通路抑制自噬，增强微环境适应性。TF模块分析显示MYBL2、NFYB、E2F2、TGIF1和RXRG富集，支持C3亚群由协调的转录程序维持。体外实验证实UBE2C敲低抑制增殖、克隆形成、迁移并促进凋亡。研究局限性包括基于单一公共数据集、回顾性数据可能存在的选择偏差、恶性细胞注释依赖计算推断、伪时间分析为统计模型而非真实时序、细胞间通讯预测需实验验证，以及体外验证仅局限于两种细胞系。结论部分翻译如下：总体而言，本研究提供了SCLC恶性细胞异质性的整合性单核视角，并将UBE2C⁺增殖性肿瘤细胞鉴定为一个功能上经过验证的恶性状态，该状态与免疫-基质调控网络相连。这些发现提示UBE2C可能作为SCLC细胞恶性表型的功能相关调控因子，并鉴定出GRN-SORT1和THBS1-CD47/CD36作为需要进一步实验验证的候选通讯轴。尽管需要在更大队列和更多实验模型中进一步验证，但本研究为研究小细胞肺癌中肿瘤细胞的可塑性及鉴定潜在可调控靶点提供了一个框架。