miR-1260b–NFAT5轴调控牙周炎中炎症小体启动与M1巨噬细胞极化

《Frontiers in Immunology》：The miR-1260b–NFAT5 axis regulates inflammasome priming and M1 macrophage polarization in periodontitis

　　

引言：巨噬细胞驱动的炎症程序以及NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体在牙周组织破坏中发挥关键作用；然而，介导这些反应的转录调节因子仍不清楚。本研究因此考察了microRNA-1260b（miR-1260b）–活化T细胞核因子5（NFAT5）轴在牙周炎相关炎症性巨噬细胞反应中的作用。方法：利用整合生物信息学筛选将NFAT5鉴定为miR-1260b的候选靶标，并在RAW264.7巨噬细胞中通过功能获得与功能缺失方法进行探究。炎症小体相关实验在J774A.1巨噬细胞中采用脂多糖（LPS）/ATP双信号刺激方案进行。进一步分析包括局部递送NFAT5小干扰RNA（siRNA）的丝线结扎诱导小鼠实验性牙周炎模型、脂多糖（LPS）与干扰素-γ（IFN-γ）刺激的小鼠骨髓来源巨噬细胞的巨噬细胞极化检测，以及在人外周血单个核细胞（PBMC）来源巨噬细胞中的验证实验。结果：转染miR-1260b可降低NFAT5表达并减弱LPS诱导的巨噬细胞核内累积。体内分析显示发炎牙龈组织中NFAT5表达升高，而局部敲低NFAT5伴随NLRP3和白细胞介素-1β（IL-1β）表达降低。在J774A.1巨噬细胞中，LPS/ATP刺激下沉默NFAT5可降低Nlrp3与Il1b mRNA表达，同时降低NLRP3与pro-IL-1β蛋白水平以及培养上清中IL-1β水平。额外体外实验表明NFAT5沉默后M1相关炎症基因表达减少。流式细胞术进一步显示NFAT5敲低后CD86+巨噬细胞亚群比例下降，且在小鼠与人巨噬细胞系统中促炎细胞因子产生均减少。讨论：上述发现确定NFAT5为炎症小体启动的关键调节因子，促进牙周炎症中炎症性巨噬细胞极化，并提示miR-1260b–NFAT5轴可作为宿主调节策略的潜在靶点。

研究背景与立项依据

牙周炎是一种由慢性、失调的宿主炎症反应应答致生态失调细菌生物膜而引发的牙槽骨丧失疾病。NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体作为感知微生物及危险信号的多蛋白复合体，通过激活caspase-1成熟白细胞介素（IL）-1β与IL-18，在牙周组织炎症与骨吸收中发挥核心作用。经典NLRP3活化依赖LPS介导的“启动（priming）”信号与ATP等“激活”信号双阶段。巨噬细胞是IL-1β主要来源，并决定M1（经典活化，促炎）与M2（替代活化，促修复）平衡；M1表型高表达IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及IL-6，且NLRP3活性增强。既往研究发现TNF-α可诱导miR-1260b并调控破骨细胞生成，但miR-1260b直接关联巨噬细胞表型及机制未明。活化T细胞核因子5（NFAT5，亦称TonEBP）原为高渗应激应答转录因子，新近证据提示其参与巨噬细胞活化与NLRP3通路，且牙周炎症组织常伴高渗环境，然其在巨噬细胞介导牙周炎症中的地位未阐明。研究人员据此假设miR-1260b–NFAT5轴调控巨噬细胞NLRP3/IL-1β应答，开展体内外机制研究，论文发表于《Frontiers in Immunology》。

主要关键技术方法（≤250字）

研究人员采用mirDIP数据库预测miR-1260b靶基因；使用雄性C57BL/6NCrSlc小鼠（8周龄，n=5/组）构建丝线结扎上颌第二磨牙7天实验性牙周炎模型，并以jetPEI包裹NFAT5 siRNA局部龈乳头注射（第0、3天）；原代细胞含小鼠股骨胫骨骨髓经M-CSF诱导7天骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）、人商用去标识CD14⁺单核细胞经M-CSF诱导PBMC来源巨噬细胞；细胞系用RAW264.7与J774A.1。功能干预为HiPerFect转染miR-1260b mimic或NFAT5 siRNA。刺激方案分两类：J774A.1用LPS（100 ng/mL）3–6 h接ATP（5 mM）45 min双信号；BMDMs及人巨噬细胞用LPS（10 ng/mL）+IFN-γ（25 ng/mL）24 h诱导M1。检测技术含核质分离Western blot、qRT-PCR、ELISA、共聚焦免疫荧光定量、流式细胞术（小鼠F4/80⁺CD86⁺/CD206，人CD11b⁺CD86⁺/CD206）。

研究结果

3.1 miR-1260b抑制LPS刺激巨噬细胞NFAT5表达与核定位

研究人员在RAW264.7中转染miR-1260b mimic后LPS刺激，核蛋白Western与免疫荧光显示核NFAT5蛋白及荧光强度显著低于对照，证明miR-1260b负向调控NFAT5表达及核转位。

3.2 NFAT5在小鼠实验性牙周炎上调并促进牙龈NLRP3/IL-1β表达

丝线结扎小鼠牙龈免疫荧光示NFAT5高于非结扎；局部si-NFAT5降NFAT5信号，qRT-PCR示Nlrp3与Il1b mRNA同步下调，表明NFAT5体内诱导并转录上调NLRP3与IL-1β。

3.3 NFAT5敲低减弱J774A.1在LPS/ATP下的启动期炎症小体应答

J774A.1转si-NFAT5后LPS/ATP刺激，Nfat5/Nlrp3/Il1b mRNA受抑；核NFAT5、全细胞NLRP3与pro-IL-1β蛋白下降，上清IL-1β（ELISA）减少。因未测caspase-1切割与成熟IL-1β加工，结论限定于启动（priming）阶段调节。

3.4 NFAT5沉默抑制BMDMs中M1极化

小鼠BMDMs经LPS+IFN-γ诱导，si-NFAT5降核NFAT5转位，抑Nfat5及M1基因Nos2、Tnfa、Il1b、Il6转录；流式F4/80⁺CD86⁺及CD86⁺CD206^?亚群比例降；上清IL-1β、TNF-α减少，证NFAT5促M1极化。

3.5 人PBMC来源巨噬细胞NFAT5依赖极化保守

人巨噬细胞同方案诱导，si-NFAT5下调NFAT5、TNF、IL1B、IL6 mRNA；流式CD11b⁺CD86⁺比例显著降，CD86⁺CD206^?倾向降，跨物种印证NFAT5维持M1偏斜表型。

讨论部分总结

研究人员在讨论中指出，巨噬细胞驱动炎症为牙周发病核心，NFAT5被确立为关联M1极化与NLRP3启动的转录调节因子，miR-1260b负向约束该轴。NLRP3活化属转录调控过程，NFAT5敲低主要作用于启动而非激活后期（未检caspase-1切割）。牙周微环境具炎症叠加高渗（龈沟液Na⁺、K⁺升高）双重线索，但本研究未控渗透压，故miR-1260b–NFAT5是否依赖高渗未定。体内NFAT5上调、局部敲低抑NLRP3/IL-1β，联合既往miR-1260b mimic局部注射减轻骨吸收表型，支持该miRNA经EV递送调控NFAT5通路。NFAT5除启动炎症小体，还促M1并可与NF-κB协同结合启动子，但直接染色质结合未验证，且缺巨噬细胞特异性基因敲除体内因果。靶向NFAT5较单细胞因子干预可同时抑细胞因子、炎症小体效能与极化程序。

结论部分翻译

本研究确定NFAT5为牙周炎中炎症小体启动与炎症性巨噬细胞极化的关键调节因子。miR-1260b抑制NFAT5表达与核定位，而NFAT5沉默降低NLRP3表达、Il1b转录、pro-IL-1β蛋白水平及培养上清IL-1β。上述发现提示miR-1260b–NFAT5轴参与调控巨噬细胞驱动炎症，并可能作为牙周炎宿主调节治疗的潜在靶点。由于未直接检测激活期炎症小体事件，仍需进一步研究明确NFAT5是否参与NLRP3炎症小体激活阶段。