AQbD指导下的稳健绿色SI-RP-HPLC方法开发，用于埃夫尼地平盐酸乙酯与氯噻酮复合制剂的杂质分析，并结合LC–MS和NMR技术鉴定埃夫尼地平的降解产物

《Journal of Chromatography A》：AQbD-Guided Development of a Robust and Green SI-RP-HPLC Method for Impurity Profiling of an Efonidipine Hydrochloride Ethanolate and Chlorthalidone Combination, with LC–MS and NMR-Based Identification of Degradation Product in Efonidipine

　　•建立了首个绿色QbD优化型RP-HPLC方法，用于检测盐酸埃芬地平乙酸酯与氯噻酮复合制剂的杂质。•通过使用可持续的Zorbax SB C8色谱柱及优化的流动相（绿色溶剂），实现了对杂质的优异分离效果。•利用LC-MS和NMR技术鉴定并表征了埃芬地平相关化合物A（光解降解产物），同时提出了其降解途径。•通过QbD关键参数优化（流动相组成、pH值），证明了该方法的卓越稳健性。•该方法已按照ICH Q2(R1)指南进行验证：精密度（%RSD <2%）、准确度（回收率98-102%）、线性度（R2 >0.999）。•这种环保型方法在保持分析性能的同时，可将有机溶剂的使用量减少40%。•为高血压复合疗法制剂中的稳定性指示杂质分析提供了可扩展的解决方案。

引言
高血压，即血压过高，是一种常见的健康问题，通常没有明显症状，因此被称为“沉默的杀手”。若未能有效控制，高血压可能导致严重的健康并发症。高血压的成因多种多样。为有效管理高血压，医疗专业人员通常会建议患者改善饮食习惯、增加体力活动，并坚持按医嘱服药。固定剂量组合药是一种实用且高效的高血压管理方法。通过将多种降压药整合到一片药片中，固定剂量组合药可以提高患者的用药依从性，减少用药错误，并提升治疗效果。常见的固定剂量组合包括ACE抑制剂与噻嗪类利尿剂、ARBs与噻嗪类利尿剂、钙通道阻滞剂与噻嗪类利尿剂的组合，以及三联组合。盐酸埃芬地平乙酸酯和氯噻酮是两种用于控制高血压的降压药。（图1A-1B）这两种药物常被联合用于复合疗法，相较于单独使用任何一种药物，更能有效控制血压。盐酸埃芬地平乙酸酯是一种1,4-二氢吡啶类钙通道阻滞剂，具有独特的分子结构，由乙醇与盐酸埃芬地平等摩尔结合而成。其晶体结构中，氯离子呈篮状排列，这有助于提高热稳定性并减少氯离子的释放[1]。尽管盐酸埃芬地平乙酸酯的pKa值尚未有明确报道，但类似二氢吡啶类钙通道阻滞剂的pKa值通常在2到5之间，这一数值会影响其在生理pH值2条件下的电离和吸收情况[2]。虽然其log P值未直接给出，但盐酸埃芬地平乙酸酯的低水溶性和高脂溶性表明其log P值相当高，从而具备良好的膜通透性。盐酸埃芬地平乙酸酯与氯噻酮在物理化学性质上的显著差异，给同时进行杂质分析带来了很大挑战。盐酸埃芬地平乙酸酯具有很强的亲脂性，与反相色谱固定相之间存在强烈的疏水相互作用，而氯噻酮的极性相对较高，且电离行为也有所不同。因此，为了实现有效的色谱分离，需要仔细优化固定相成分、流动相极性以及pH值，以获得平衡的保留时间、更高的选择性和良好的杂质及降解产物分离效果。

氯噻酮是一种含有苯并噻二嗪环的噻嗪类利尿剂，因其良好的水溶性和较长的半衰期而备受关注，其半衰期较长是因为该药物能与血浆蛋白高度结合，且通过肾脏缓慢排出。其磺胺基团对应的pKa值约为9.4，在生理pH值下，该药物大多处于非电离状态，这有利于其被重新吸收。在分析分离过程中，通常使用pH值为4–4.5的流动相[[3], [4], [5]]。此外，氯噻酮的log P值约为2.4，说明其具有中等程度的亲脂性，这有助于其通过口服途径被吸收并分布到体内各组织。有研究指出，HPLC、GC、UV-Vis光谱法和质谱法是检测盐酸埃芬地平乙酸酯的关键技术，这些方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性[[6], [7], [8], [9]]。对于氯噻酮，也有大量文献报道了HPLC、HPTLC和UV光谱法的应用，这些方法在特异性、线性度和准确度方面都经过了验证[[10], [11], [12]]。氯噻酮已被列入印度、英国、美国和欧洲等国家的药典中。目前已有针对氯噻酮（单独使用或与其他药物联合使用）的稳定性指示RP-HPLC分析方法，这些方法能够分离出降解产物和工艺相关杂质，并且已按照ICH指南进行了验证[13,14]。HPTLC方法则为杂质分析提供了更为环保的替代方案，它具有较高的灵敏度，适合常规分析使用[15,16]。对于氯噻酮与其他降压药（如阿泽尼地平、西尼地平、替米沙坦、氨氯地平）联合使用的分析方法，也包括RP-HPLC、HPTLC和UV光谱法，这些方法均已经过药品分析方面的验证[17,18]。最近有一些研究建立了环保型的RP-HPLC和UV光谱法，可用于同时测定片剂制剂中的盐酸埃芬地平乙酸酯和氯噻酮含量。然而，目前尚无关于这两种药物共同存在的杂质的分析报道。尽管已有不少研究报道了单独检测盐酸埃芬地平乙酸酯和氯噻酮，或是检测它们与其他降压药联合使用时的含量，但大多数研究主要侧重于测定药物的浓度，而非全面的杂质分析和稳定性评估。此外，关于盐酸埃芬地平乙酸酯的降解行为和杂质谱的信息也非常有限，尤其是因为这种物质尚未被纳入主要药典中。由于盐酸埃芬地平乙酸酯和氯噻酮在物理化学性质、降解途径以及色谱行为方面存在显著差异，对其同时进行杂质分析面临很大挑战。此外，以往针对其他降压药组合的RP-HPLC分析方法，通常采用传统的试错式优化方式，较少重视系统性的风险评估、最佳操作条件的确定以及环境可持续性方面的考虑。因此，本研究旨在开发一种综合性的稳定性指示杂质分析方法，该方法结合了分析质量设计理念、实验设计方法以及绿色分析化学原则，以此提升方法的稳健性，实现基于整个产品生命周期的分析控制，并降低对环境的影响。此外，本研究还利用LC–MS和NMR技术对盐酸埃芬地平乙酸酯的光解降解产物进行了结构表征，从而为了解光敏感型二氢吡啶类物质的降解机制提供了更多依据[19]。

药品杂质指的是在药品生产或储存过程中产生的、可能带来安全风险的非预期化学物质。由于这些杂质可能影响药品的安全性评估，监管机构会对药品中允许存在的杂质含量设定限制。了解固定剂量组合药中的杂质非常重要，因为不同药物之间常常会发生相互作用。值得注意的是，盐酸埃芬地平乙酸酯在各类药典中的正式记载十分有限，因此关于其杂质的资料也非常少。Pandya和Rajput研究了可能导致杂质产生的各种途径。氯噻酮杂质B被认为是与氯噻酮相关的降解产物，见图1C。在药品研发过程中，分析工作起着至关重要的作用，同时人们也越来越重视绿色分析化学理念，旨在通过使用环保型化学品、优化能源消耗等方式，最大限度地减少对环境的影响，同时保障分析人员的健康。分析质量设计是一种基于风险的战略，它贯穿于分析方法的整个开发与验证过程，其主要目标是识别那些对确保数据完整性/可靠性至关重要的关键参数，同时提升分析过程的稳健性和有效性，从而避免可能出现的问题，最终提高产品的整体质量。最近的监管指南，尤其是ICH Q14和ICH Q2(R2)，强调了基于科学和风险的分析方法开发的重要性，这类开发应运用预先定义的分析目标参数、系统地识别分析方法属性，并采用结构化的风险评估方法。在基于分析质量设计的色谱方法开发中，分析目标参数明确了分析方法的预期用途及其所需的性能特征，而分析方法属性则代表了那些对确保方法适用性和可靠性至关重要的可测量分析结果。通过采用结构化的风险评估和多元实验设计，可以更好地理解关键方法参数与分析性能之间的关系，进而提升方法的稳健性、一致性以及基于整个产品生命周期的分析控制能力。在药品分析领域，推行绿色实践的必要性尤为突出，这是因为高效液相色谱法在常规药品质量检测过程中往往会产生大量有害的有机废物。尽管越来越多的研究致力于开发更环保的色谱技术，但由于人们对其效果仍存疑虑，制药行业在采用环保型高效液相色谱方法方面仍显得犹豫不决。绿色化学旨在创造那些能够减少或消除有害物质使用和产生的化学产品及工艺[20,21]。本研究的目的是尽量减少有机溶剂的使用，同时限制污染物向环境的排放。虽然为了获得良好的色谱分离效果和实现杂质分离，必须使用乙腈和甲醇等有机溶剂，但本研究采用的分析策略旨在尽量减少溶剂消耗，降低与传统杂质分析RP-HPLC方法相比的整体环境影响。因此，所开发的这种方法只能被视为具有中等环保程度，而非完全无害于环境。目前有一些工具可用于评估分析方法的环保程度，比如分析生态尺度、分析绿色度（AGREE）以及绿色分析方法指数（GAPI）。在本研究中，就使用了这三种工具来评估所提出方法的环保性。近年来，方法开发越来越注重绿色化学理念，尤其是在RP-HPLC和UHPLC等技术中。这类方法在液相色谱分析中通常会使用大量有毒的有机溶剂。随着人们越来越意识到这些方法对环境造成的危害，一些指导方针应运而生，旨在推动开发更加可持续的分析方法。

仪器与软件
本研究所建立的分析方法是在岛津i系列高效液相色谱仪上开发的，该色谱仪配备了LC 2050 C 3D PDA检测器。在整个研究过程中，岛津公司的Lab Solution软件用于数据的收集、处理和报告工作，而来自美国明尼阿波利斯的Stat-Ease Inc.公司的Design Expert-12软件则用于优化关键方法参数。所使用的色谱柱包括Intersil Hypersil YMC Triart Zorbax系列，这些色谱柱的颗粒尺寸为5微米。

RP-HPLC方法开发
本研究的主要目标是提供一种简单高效的稳定性指示分析方法，利用HPLC技术检测盐酸埃芬地平乙酸酯和氯噻酮中的杂质，该方法既能实现高分辨率的分析，又能缩短分析时间。在通过光谱技术定量测定药品配方中的盐酸埃芬地平乙酸酯、氯噻酮及其相应杂质时，由于安慰剂中可能存在不同的辅料，往往会出现特异性问题。在HPLC方法开发中，分辨率是指方法区分不同组分的能力……

结论
本研究描述了一种用于检测盐酸埃芬地平乙酸酯与氯噻酮复合制剂中杂质的、稳健且具有稳定性指示功能的RP-HPLC分析方法的开发与验证过程。该方法结合了分析质量设计理念，通过实验设计方法对色谱条件进行了系统优化，从而提升了方法的稳健性、选择性和精确度。所开发的该方法具有很高的灵敏度，能够检测并定量分析各种应力条件下的微量杂质和降解产物。

利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。

数据可用性声明
如需获取支持本研究文章的数据，可向相应作者提出合理请求后获取。

CRediT作者贡献声明
Pranav S. Bang：撰写原文初稿、数据可视化、方法设计、实验实施、概念构思。Vishnu P. Choudhari：撰写审稿与编辑内容、项目监督。Vikram S. Gharge：项目监督、软件应用、资源提供。

利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何已知的、可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢
作者感谢Zuventus Healthcare Ltd.为这项研究提供了必要的实验室设施。

Pranav S. Bang|Vishnu P. Choudhari|Vikram S. Gharge