AAA蛋白酶paraplegin（SPG7）和FtsH的N端结构差异表明其在复合物形成中具有关键的结构功能

《Journal of Structural Biology》：Structural divergence in N-terminal domains of AAA proteases paraplegin (SPG7) and FtsH indicates a key structural function in complex formation

　　•截瘫蛋白和FtsH的IMS区域都能形成独立的、由α/β折叠结构构成的结构域。•在溶液中，截瘫蛋白-IMS与FtsH-IMS会呈现不同的寡聚状态，但不会形成具有生物学意义的六聚体。•对截瘫蛋白-IMS的首个原子结构分析显示存在结构域交换的二聚体形式。在1.5微秒的分子动力学模拟中，这种结构域交换后的截瘫蛋白IMS区域结构依然保持不变。

引言
与多种细胞活动相关的ATP酶家族——AAA+蛋白，在动物、植物以及细菌中都高度保守，它们在维持细胞稳态方面起着至关重要的作用。AAA蛋白酶的功能障碍会导致细胞功能出现严重且多方面的紊乱。在细菌中，删除细菌AAA蛋白酶FtsH会使得大肠杆菌死亡（Tomoyasu等人，1993年），并导致枯草芽孢杆菌的生长出现严重缺陷（Deuerling等人，1997年），这表明AAA蛋白酶在维持细胞稳态和存活方面具有关键作用。在真核生物中，线粒体中的AAA蛋白酶负责维持线粒体蛋白质稳态，这对于调控线粒体蛋白质组以及相关的细胞功能至关重要，这些功能包括亚细胞蛋白质运输、降解受损、错误折叠或多余的蛋白质，以及清除受损的线粒体（Tatsuta等人，2007年；Kihara等人，1998年；Kolodziejczak等人，2018年；Pareek等人，2018年）。这些蛋白功能的紊乱与癌症（Bulteau和Bayot，2011年）以及神经退行性疾病（Rugarli和Langer，2012年；Murru等人，2019年）等病理状况有关。截瘫蛋白是一种人类线粒体mAAA蛋白酶，最初因为其与遗传性痉挛性截瘫病的关联而被发现并命名（Casari等人，1998年；Martinelli等人，2009年），该疾病通常表现为下肢逐渐出现的痉挛和无力症状。

在分子层面，AAA蛋白酶大多为同源六聚体复合物，比如细菌中的FtsH蛋白酶（Akiyama等人，1995年；Krzywda等人，2002年），不过有些同源蛋白的亚基组成可能存在差异。线粒体中的FtsH样AAA+蛋白酶要么面向线粒体基质，要么面向膜间隙，这使得不同结构的蛋白酶之间有可能发生功能相互作用（Koppen和Langer，2007年）。在人类线粒体中，mAAA蛋白酶六聚体可以是AFG3L2亚基组成的同源寡聚复合物，也可以是AFG3L2与截瘫蛋白/SPG7共同组成的异源寡聚复合物（Koppen等人，2007年）。在酵母中，已经发现了两种mAAA蛋白酶亚基Yta10和Yta12，它们分别是AFG3L2和SPG7的同源物（Arlt等人，1996年），并且通过12埃分辨率的冷冻电子断层扫描技术，人们已经获得了它们的异源六聚体结构图（Lee等人，2011年）。不同物种中AAA蛋白酶的寡聚状态和组装方式的差异可能意味着其结构本身存在细微差别，而这些差别或许会影响其底物特异性和功能，因此值得进一步研究（Puchades等人，2019年）。例如，线粒体m-AAA蛋白酶复合物中亚基组成的差异与遗传性痉挛性截瘫病有关（Koppen等人，2007年），这直接表明复合物的组成与其功能之间存在关联。

单个m-AAA蛋白酶亚基包含两个N端跨膜螺旋，这两个螺旋将六聚体蛋白酶固定在线粒体内膜上，AFG3L2和截瘫蛋白、酵母中的Yta10和Yta12都是如此（Steele和Glynn，2019年），而植物中的AtFtsH3和AtFtsH10也是如此（Piechota等人，2010年）；而细菌中的FtsH则将其固定在外膜上（Vostrukhina等人，2015年；Langklotz等人，2012年）。随后，具有催化功能的C端ATP酶结构域和金属肽酶结构域则分别突出到线粒体基质或细胞质中（Langklotz等人，2012年；Langer，2000年；Ogura和Wilkinson，2001年；Guha等人，2011年）。目前，我们已经获得了大肠杆菌FtsH的C端ATP酶结构域和肽酶结构域的结构信息（PDB编号1LV7，Krzywda等人，2002年）、海洋热袍菌FtsH的结构信息（PDB编号3KDS，Bieniossek等人，2009年）以及人类AFG3-L2的结构信息（PDB编号6NYY，Puchades等人，2019年），这些蛋白的核苷酸结合态和无核苷酸态都已经被通过结晶或冷冻电镜技术解析出来。此外，Suno及其同事在2006年还解析出了具有功能性的细胞质六聚体复合物的三维结构，其外径在120埃到135埃之间。

相比之下，尽管有研究表明删除FtsH及相关AAA蛋白酶亚基的N端区域会损害其功能（Lee等人，2011年），并降低同源寡聚体的形成率（Akiyama和Ito，2000年），但AAA蛋白酶的N端区域却较少受到关注。这种情况会严重限制对嵌入膜内的底物的降解能力（Korbel等人，2004年），这表明N端跨膜结构域在寡聚体形成和蛋白酶功能方面起着关键作用。目前关于N端区域拓扑结构的研究表明，该区域包含两个N端跨膜螺旋，这两个螺旋包裹着一个约70个残基大小的膜间隙结构域，这个结构域会突出到线粒体两层膜之间的膜间隙中，或者突出到外膜中（Langer，2000年；Winter，2008年；Scharfenberg等人，2015年）。关于这个结构域的结构信息，我们可以从海洋热袍菌FtsH的晶体结构（PDB编号4M8A）和大肠杆菌FtsH的晶体结构（PDB编号4V0B）、FtsH的核磁共振结构（PDB编号2MUY）以及AFG3-L2的核磁共振结构（PDB编号2LNA，Ramelot等人，2013年）中获取，这些结构都显示出由两个螺旋和四条反平行的β链构成的混合折叠结构。不过，目前还不存在人类截瘫蛋白N端区域的结构信息。如果能获得该区域的结构数据，并将其与截瘫蛋白同源物的结构特征进行比较，就能让我们更深入地了解AAA蛋白酶的结构与功能关系以及底物识别机制，而这对于理解遗传性痉挛性截瘫病等疾病而言至关重要。为此，为了获得更多见解，我们着手比较了人类线粒体截瘫蛋白与它的细菌同源物FtsH在溶液状态下结构上较为保守的N端AAA蛋白酶结构域的特性。这两种蛋白都是通过重组方式制备的，我们利用圆二色光谱、小角X射线散射、小角中子散射以及X射线晶体学技术对它们进行了分析。SAXS分析结果表明，FtsH-IMS在溶液中会形成同源二聚体，而截瘫蛋白-IMS在溶液中则为结构完整的单体，但出人意料的是，它在结晶时却会形成结构域交换后的同源二聚体。总体而言，我们的研究结果可以为AAA蛋白酶六聚体的形成提供一种合理的模型，即N端结构域的交换所导致的二聚化过程或许有助于寡聚体的形成，进而影响复合物的稳定性及底物特异性。

片段内容
生物信息学分析与多序列比对
我们使用了ClustalW软件（Higgins等人，1994年）对来自大肠杆菌的FtsH、酵母中的Yta10和Yta12、以及来自小鼠和人类的AFG3L2和截瘫蛋白的mAAA蛋白酶亚基序列进行了比对。二级结构则是通过晶体结构（FtsH的ATP酶结构域，PDB编号1LV7，以及肽酶结构域，PDB编号2DI4）和/或PSIPRED软件（McGuffin等人，2000年）的二级结构预测结果来确定的。在多序列比对过程中，我们特意调整了比对参数，以保留各种结构特征。

AAA蛋白酶的N端区域在结构上具有高度保守性
我们对比了人类截瘫蛋白和AFG3L2以及细菌FtsH的N端区域的初级结构和二级结构元素，旨在找出可能与其功能相关的保守结构模式。在评估初级结构时，我们对人类截瘫蛋白的N端IMS区域（163至249号残基）、FtsH的N端IMS区域（20至97号残基）以及人类AFG3L2的N端IMS区域（168至248号残基）进行了成对序列比对，结果显示截瘫蛋白IMS区域与FtsH-IMS区域的序列相似度相对较低，仅为14%，而截瘫蛋白IMS区域与……之间的序列相似度也较低。

讨论
对多结构域膜蛋白的结构分析是结构生物学领域的一项重大挑战，尤其是对于那些能形成大型大分子复合物的蛋白来说。当完整长度的蛋白复合物无法通过常规的蛋白制备方法进行解析时，将这类多结构域膜蛋白拆分成各个独立的结构域，就是一种有效的获取结构信息的策略。在本文中，我们对……的N端结构域（IMS区域、外部区域或膜间隙结构域）进行了结构分析。

CRediT作者贡献说明
James G. Hyatt：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，可视化，研究工作，正式分析，数据整理。Neil G. Paterson：写作——审稿与编辑，正式分析，数据整理。Juliette M. Devos：写作——审稿与编辑，研究工作。Cristiano L.P. Oliveira：写作——审稿与编辑，研究工作，正式分析。Christian M. Jessen：研究工作，正式分析。Sylvain Prevost：写作——审稿与编辑，验证工作，研究工作，正式分析。

利益冲突声明
作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Anja Winter指出，她所使用的设备、药物或实验用品是由ESRF提供的；她还提到这些物品是由Institut Laue-Langevin提供的；此外，这些物品还来自Diamond Light Source Ltd.，以及利物浦大学。Anja Winter……

致谢
本项研究得益于能够使用EMBL的HTX实验室设施以及PSB设施。作者们要感谢Jose A. Marquez和Guillaume Hoffmann在协助使用这些设施方面给予的帮助。开展这项研究的工作得到了欧洲共同体“地平线2020”计划第七框架项目iNEXT的资助，相关资助协议编号为N653706。同时，我们还要感谢ILL为我们提供Deuteration Laboratory（ILL D-Lab）的使用机会以及相应的资源支持。作者们致以感谢……

James G. Hyatt|Neil G. Paterson|Juliette M. Devos|Cristiano L.P. Oliveira|Christian M. Jessen|Sylvain Prevost|Andreas Hofmann|Jan Skov Pedersen|Anja Winter