《Microchemical Journal》：A sustainable LC–MS method for determination of genotoxic impurity 1-(2-chloroacetyl)pyrrolidine-2-carboxamide (CAPCA): Assessment by advanced green analytical metrics
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•该研究开发了一种新方法，用于检测和定量维格列汀活性药物成分中的CAPCA基因毒性杂质。•通过绿色化学软件对该方法的环境影响进行了评估。•本研究采用了AGREE、NEMI和MoGAPI这些工具。•所开发的方法有效降低了成本和时间消耗。引言用于治疗2型糖尿病的最常见药物之一是维格列
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该研究开发了一种新方法，用于检测和定量维格列汀活性药物成分中的CAPCA基因毒性杂质。
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通过绿色化学软件对该方法的环境影响进行了评估。
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本研究采用了AGREE、NEMI和MoGAPI这些工具。
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所开发的方法有效降低了成本和时间消耗。
引言
用于治疗2型糖尿病的最常见药物之一是维格列汀，这是一种口服降糖药，属于二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂类。它的药理作用在于能够抑制DPP-4酶，进而促使肠促胰岛素如胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性胰岛素促泌多肽（GIP）发挥长期作用，而这些激素都参与葡萄糖调节[1]。当肠促胰岛素水平上升时，就能更好地控制餐后及整体血糖水平，因为这类激素能促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放，并减少肝脏葡萄糖合成。在活性药物成分及成品制剂中存在基因毒性杂质（GTIs）已成为药品质量保证领域的重大问题，因为它们可能引发不可逆的基因损伤，包括基因突变、染色体异常以及DNA链改变[2]。这类变化可能诱发致癌过程，从而对人类健康造成长期风险。这些杂质可能源自起始原料、中间体、试剂、催化剂、溶剂、降解产物，或是生产过程中出现的意外副反应。尽管通过工艺优化和纯化策略可以显著减少杂质的生成，但完全消除往往较为困难；因此，对GTIs进行严格监测和控制至关重要。
维格列汀被广泛用于治疗2型糖尿病成人患者，其分子结构如图1所示。在维格列汀的合成过程中会使用到1-(2-氯乙酰)吡咯烷-2-羧酰胺（CAPCA）这类中间体。CAPCA含有亲电结构特征，能够与DNA中的亲核位点发生反应，进而可能导致致突变和致癌效应。由于这种中间体直接参与维格列汀的合成路径，因此最终活性药物成分中仍可能存在其残留。此外，根据基于定量结构-活性关系（QSAR）模拟的计算毒理学预测，CAPCA也被归类为可能的基因毒性或致癌杂质[3]。图2展示了与维格列汀生产相关的合成路径。
文献中已有大量研究指出，氯取代官能团和活性酰胺衍生物等结构特征可能与基因毒性风险相关。鉴于这些结构可能带来的安全问题，监管机构要求严格控制药品中这类物质的含量。欧洲药品管理局（EMA）、美国食品药品监督管理局（FDA）以及国际协调委员会（ICH）都出台了相关法规，明确了评估潜在风险、认证药品以及控制基因毒性杂质的最佳实践[4]、[5]、[6]。根据ICH M7(R2)标准，70年暴露期内每10万人中1例的耐受理论终生癌症风险对应的安全剂量为1.5微克/天，这一数值也是致突变污染物的毒理学关注阈值。通过以下公式可确定CAPCA的可接受浓度限：杂质限值（ppm）= 可接受日摄入量（微克/天）/ 最大日剂量（克/天），其中维格列汀的最大日剂量为100毫克/天。借助气相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法、气相色谱法以及电感耦合等离子体质谱法等多种分析技术，可以检测出药品中的微量杂质[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。然而，CAPCA的沸点相对较高，且缺乏强发色团，这使得传统的基于气相色谱或紫外光的检测方法因挥发性差、热稳定性低以及检测灵敏度有限而不太适用。尽管在气相色谱-质谱法中采用选择性离子监测技术比火焰离子化检测或电子捕获检测等传统检测器具有更高的选择性，但单级质谱分析仍存在基质干扰问题[27]、[28]。而采用多反应监测模式的液相色谱-质谱/质谱技术则可通过串联质谱分析实现前体离子选择、碰撞诱导解离以及对产物离子的选择性监测，从而大幅提升检测的灵敏度和选择性。通过这种双重过滤机制，基质干扰可大幅降低，复杂药品基质中的痕量污染物也能被准确定量[29]、[30]。对于那些不易挥发、极性较强或热不稳定的化学物质，液相色谱-质谱/质谱法是首选的分析手段，因为它能够在百万分之几到十亿分之几的浓度范围内实现精准定量。本研究旨在开发并验证一种符合USP <1225>、ICH Q2(R2)以及ICH M7(R2)标准的液相色谱-质谱/质谱技术，用于检测维格列汀活性药物成分中的CAPCA[4]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。据我们所知，目前尚无研究报道过使用液相色谱-质谱/质谱法检测维格列汀活性药物成分中的CAPCA。此外，目前仅有一种检测方法可用于维格列汀缓释片剂的检测[36]。表1汇总了现有相关研究的对比情况。随着绿色化学领域的不断发展，人们开始寻求系统化的方法来评估分析方法的环境可持续性。其中应用最广泛的评估体系包括分析绿色度指标（AGREE）、分析生态尺度以及绿色分析流程指数模型（MoGAPI）。分析生态尺度是通过根据分析方法对环境造成的影响扣除相应罚分，从而量化其绿色程度[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]。而AGREE和MoGAPI则是更为先进的评估方法，它们将绿色分析化学的十二项原则融入到综合评分体系中。值得一提的是，由波兰格但斯克工业大学开发的AGREE工具能够以直观且量化的形式展示分析方法的绿色程度，便于不同方法之间的横向比较。总体而言，这三类评估指标都能有效验证分析方法的可持续性，帮助研究人员依据既定的绿色化学原则对各种分析方法进行对比评估。这些基于绿色分析化学原则的工具，能够全面评估分析方法对环境的影响程度。
在本研究中，我们成功建立了一种稳健、经过验证且具备环保意识的液相色谱-质谱/质谱分析方法，可用于检测维格列汀活性药物成分中的1-(2-氯乙酰)吡咯烷-2-羧酰胺（CAPCA）的痕量含量。该分析方法表现出良好的灵敏度、选择性和可靠性，完全可以应用于常规质量控制实验室，用于有效监测与生产过程相关的基因毒性杂质，确保药品生产符合现行监管要求。
章节要点
材料与试剂
维格列汀（纯度99%）和CAPCA（1-(2-氯乙酰)吡咯烷-2-羧酰胺）均从印度Merck公司采购。用于液相色谱-质谱分析的甲醇和甲酸则购自印度Biosolve公司。在进行分析之前，包括样品和流动相在内的所有溶液都会经过Merck Millipore公司提供的0.45微米膜过滤器过滤。所有实验中所使用的水均为通过Milli-Q系统（Merck Millipore公司产品）净化处理过的超纯水。
优化稀释剂、色谱柱及色谱条件
本研究旨在利用灵敏度较高且选择性能良好的液相色谱-质谱/质谱技术，对维格列汀这种基因毒性活性药物成分中的CAPCA杂质进行定量检测。在方法开发过程中，我们充分考虑了灵敏度、线性度、准确度以及精密度等重要的分析性能指标。通过测试不同的流动相、固定相以及洗脱模式组合，我们对色谱条件进行了精细调整，以获得最佳的分辨率和峰形。
首先
讨论
如前文所述，为了建立所提出的液相色谱-质谱/质谱分析方法，我们系统地采用了包含空白溶液、校准标准品、测试样品、加标样品以及对照标准品的特定进样顺序。本研究的主要研究对象是维格列汀活性药物成分中的一种潜在基因毒性杂质——1-(2-氯乙酰)吡咯烷-2-羧酰胺（CAPCA），旨在验证一种灵敏度较高的液相色谱-质谱/质谱分析方法用于检测该杂质的有效性。由于该分析方法具有出色的
结论
本研究成功开发了一种基于液相色谱与串联质谱技术、并配备电喷雾电离源的极为灵敏且选择性能优异的分析平台，可用于痕量水平上检测潜在的基因毒性杂质。这类分析技术在制药行业早已得到广泛应用。为准确检测维格列汀活性药物成分中的CAPCA，本研究设计并优化了一种高效的液相色谱-质谱/质谱分析技术。由于该杂质具有独特的质谱特征
CRediT作者贡献说明
Murali Mohana Reddy Mavuluru：可视化分析、方法设计、实验实施、正式数据分析、概念构建。Kousrali Sayyad：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿编写。Pravardhan Reddy Elala：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿编写。Leela prasad Kowtharapu：论文撰写——审阅与编辑、软件应用。Janardhan Reddy Kanchani：论文撰写——审阅与编辑、项目监督。Loka Subramanyam Sarma：论文撰写——初稿编写、项目监督、项目整体管理。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
作者感谢卡达帕的Yogi Vemana大学以及海得拉巴的Chemic Life Sciences Pvt. Ltd.公司为本研究提供了必要的实验设施支持。
Murali Mohana Reddy Mavuluru|Kousrali Sayyad|Pravardhan Reddy Elala|Leela prasad Kowtharapu|Janardhan Reddy Kanchani|Loka Subramanyam Sarma
