GBA1在施万细胞中缺失的小鼠模型中的周围神经病变

《Neurobiology of Disease》：Peripheral neuropathy in a mouse model lacking GBA1 in Schwann cells

　　

周围神经病变症状已在戈谢病（GD）中被报道，戈谢病是一种由β-葡萄糖脑苷脂酶基因（GBA1）突变引起的罕见溶酶体贮积症，但仅在临床环境中进行了少量研究。为了阐明施万细胞（SCs）在GD中对周围髓鞘形成的参与，研究人员生成了一种条件性敲除小鼠品系，其中髓鞘形成胶质细胞中β-葡萄糖脑苷脂酶被耗竭（Gba1f/f::cre）。成年Gba1f/f::cre周围神经表现为大直径轴突的髓鞘形成不足和髓鞘内陷频率增加，并伴有修复-SC程序激活的证据，如p75ntr和cJun的表达所示。Gba1f/f::cre小鼠表现出运动性能下降，伴随神经肌肉接头形态和神经肌肉传递的改变。鉴于β-葡萄糖脑苷脂酶在溶酶体功能和自噬中的既定作用，研究人员还研究了其在SCs中的缺乏是否会影响神经损伤反应。尽管条件性敲除小鼠能够完全恢复，但体内β-葡萄糖脑苷脂酶缺陷的SCs中髓鞘自噬（myelinophagy）的初始步骤受损，该过程是清除髓鞘碎片从而促进轴突再生所必需的。一致地，当在体外使用β-葡萄糖脑苷脂酶抑制剂conduritol B epoxide（CBE）诱导神经变性时，观察到自噬流受阻。研究人员的数据表明，缺乏β-葡萄糖脑苷脂酶的SCs中降解效率降低和/或生物活性脂质积累维持了修复-SC程序的激活，导致髓鞘和轴突缺陷。这些结果表明GBA1在保证SC溶酶体功能方面具有新作用，该功能与周围神经稳态相关。

**论文解读：GBA1在施万细胞中缺失导致周围神经病变的机制研究**

**研究背景与意义**
戈谢病（GD）是一种由β-葡萄糖脑苷脂酶基因（GBA1）突变引起的罕见溶酶体贮积症，导致葡糖脑苷脂和葡糖鞘氨醇积累。尽管1型GD传统上被归类为非神经病变型，但多项临床研究报道其患者中周围神经病变（如感觉异常、肌肉无力）的发生率显著高于普通人群，且部分症状对酶替代疗法不敏感。然而，周围神经病变的细胞机制尚不明确。施万细胞（SCs）负责周围神经的髓鞘形成，其溶酶体功能异常可能参与病理过程。该研究旨在通过构建施万细胞特异性Gba1条件敲除小鼠模型，探讨β-葡萄糖脑苷脂酶缺失对周围髓鞘稳态、神经功能及损伤修复的影响，为戈谢病相关周围神经病变提供机制解释，并揭示溶酶体功能障碍在脱髓鞘性周围神经病中的潜在作用。论文发表在《Neurobiology of Disease》。

**主要技术方法**
研究使用了来自Weizmann Institute of Science（Dr. Anthony Futerman提供）的Gba1f/+小鼠和来自Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences（Dr. Armin Klaus Nave提供）的Cnp1wt/cre小鼠，通过杂交获得施万细胞特异性Gba1条件敲除小鼠（Gba1f/f::cre）。关键方法包括：行为学测试（4肢悬挂测试评估肌肉力量、热板测试评估热敏感性）、电生理记录（复合肌肉动作电位CMAP和神经传导速度NCV）、坐骨神经挤压损伤模型及损伤后功能恢复评估（坐骨神经功能指数SFI）、离体神经变性实验（使用β-葡萄糖脑苷脂酶抑制剂conduritol B epoxide（CBE）处理野生型坐骨神经外植体）、原代施万细胞培养与分化、β-葡萄糖脑苷脂酶酶活性测定、蛋白质印迹（Western blotting）和实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因和蛋白表达、免疫荧光染色（标记髓鞘、轴突、溶酶体、修复-SC标志物等）、透射电子显微镜（TEM）分析髓鞘形态（g-ratio）和超微结构，以及神经肌肉接头（NMJ）全mount免疫荧光与形态测量（NMJ-morph分析）。

**研究结果**
**3.1 遗传性敲除SCs中的Gba1导致β-葡萄糖脑苷脂酶水平和活性降低**
通过RT-qPCR、蛋白质印迹和酶活性测定，证实Gba1f/f::cre小鼠的原代施万细胞中Gba1 mRNA、蛋白水平及酶活性均显著低于对照。成年小鼠周围神经（坐骨神经和三叉神经）中酶活性也显著降低，而mRNA水平变化较小，表明基因敲除有效。

**3.2 SCs中的β-葡萄糖脑苷脂酶对体内正常髓鞘形成是必需的**
对6月龄小鼠坐骨神经进行分析：蛋白质印迹显示髓鞘蛋白MBP水平显著降低，MAG和MPZ有下降趋势；FluoroMyelin染色显示髓鞘脂质含量减少；TEM形态学测量表明，总体g-ratio仅呈增加趋势，但按轴突直径分层后，大直径轴突的g-ratio显著增加，提示大直径轴突的髓鞘形成不足（hypomyelination）。因此，β-葡萄糖脑苷脂酶缺失不影响发育性髓鞘形成，但导致成年期髓鞘结构缺陷。

**3.3 缺乏β-葡萄糖脑苷脂酶的SCs发生自发重编程，导致免疫细胞募集**
TEM观察显示Gba1f/f::cre小鼠坐骨神经中髓鞘内陷（myelin infoldings）发生率显著增加。免疫荧光发现LAMP1和paranodal标志物CASPR双阳性结构在旁结区（paranodes）增多，提示异常溶酶体贮积。进一步检测到c-Jun阳性细胞核比例升高，p75ntr mRNA和蛋白水平升高，且p75ntr阳性细胞呈修复-SC表型（拉长形态并伴有LAMP1阳性肿胀）。此外，小胶质细胞/巨噬细胞标志物IBA1的mRNA水平和阳性细胞数量均显著增加。结果表明，β-葡萄糖脑苷脂酶缺失足以驱动SCs激活类似损伤的修复程序，并引发免疫细胞浸润。

**3.4 SCs缺乏β-葡萄糖脑苷脂酶的小鼠出现运动功能障碍**
4肢悬挂测试显示，Gba1f/f::cre小鼠（雄性和雌性）的抓握冲量（体重×时间）显著低于对照，表明肌肉力量下降。NMJ形态分析发现，突触后乙酰胆碱受体（AChR）簇的多重神经支配增加、碎片化指数升高、AChR簇面积减小且数量增多。电生理记录显示，复合肌肉动作电位（CMAP）振幅显著降低，神经传导速度（NCV）呈下降趋势。热板测试中，雌性Gba1f/f::cre小鼠热敏感性降低，雄性无显著差异。因此，SCs中β-葡萄糖脑苷脂酶缺失足以导致运动功能缺陷，与NMJ结构和神经肌肉传递异常相符。

**3.5 SCs中β-葡萄糖脑苷脂酶缺乏不影响损伤后周围神经再生，但损害早期髓鞘自噬**
坐骨神经挤压损伤后，SFI显示Gba1f/f::cre小鼠在21 dpi时恢复率与对照相似，但14 dpi略有延迟。损伤后3 dpi，Western blot显示MPZ和MBP降解减少，TEM显示更多髓鞘纤维保留，提示早期髓鞘清除受损。但7、14、21 dpi时TEM显示再生进程与对照相似。为排除巨噬细胞补偿，进行离体神经变性实验：用CBE抑制β-葡萄糖脑苷脂酶后，5 dpd时CNP1和MPZ降解减少，FluoroMyelin和MPZ碎片增多，LAMP1积累，且NH4Cl阻断自噬流后LC3B积累不显著，表明自噬流受阻。原代SCs中p62和LAMP1阳性结构积累进一步支持自噬-溶酶体降解缺陷。因此，β-葡萄糖脑苷脂酶缺失损害SCs的髓鞘自噬能力，但体内再生过程中免疫细胞可能补偿这一缺陷。

**讨论与结论**
讨论部分指出，临床研究显示1型GD患者周围神经病变发生率高，但机制不明。该研究首次在施万细胞特异性Gba1敲除小鼠中观察到类似遗传性脱髓鞘神经病（如CMT）的组织病理学特征（髓鞘内陷、修复-SC标志物激活、NMJ异常），并发现自噬-溶酶体功能障碍是核心机制。尽管体内损伤后再生能力正常，但离体实验证实髓鞘自噬早期步骤受损，提示免疫细胞可能代偿。结论翻译如下：
总之，研究人员在此报告了在髓鞘形成胶质细胞中缺乏溶酶体酶β-葡萄糖脑苷脂酶的小鼠模型，该模型显示出遗传性脱髓鞘神经病的关键特征。除了对β-葡萄糖脑苷脂酶条件敲除小鼠的表型分析外，还需要对人间神经样本进行更深入的研究以进一步支持研究人员的发现。尽管如此，所报告的数据具有很高的转化潜力：首先，它们揭示了1型GD一个被忽视的临床特征，支持重新评估“非神经病变”命名法的必要性；其次，它们强调溶酶体功能障碍可能是遗传性和散发性脱髓鞘性周围神经病的潜在病因。