《Nature Neuroscience》：A reproducible three-dimensional model of human brain tissue to investigate physiological and disease-associated microglia phenotypes
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基于干细胞（stem cell）的体外模型在阐明人脑细胞功能与相互作用方面具有巨大潜力，但存在可重复性、成熟度和细胞类型多样性的限制。特别是，长期整合成熟小胶质细胞（microglia, MG）以及研究神经炎症（neuroinflammation）一直具有挑战
基于干细胞（stem cell）的体外模型在阐明人脑细胞功能与相互作用方面具有巨大潜力，但存在可重复性、成熟度和细胞类型多样性的限制。特别是，长期整合成熟小胶质细胞（microglia, MG）以及研究神经炎症（neuroinflammation）一直具有挑战性。研究人员在此开发了一种基于人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）的三维（three-dimensional, 3D）皮质脑组织模型（3D cortical brain tissue model, 3BTM），该模型包含神经元、星形胶质细胞（astrocyte）和小胶质细胞，具有高可重复性、成熟度和存活率。3BTM 显示出所有细胞类型在形态学、功能学和蛋白质组学（proteomics）上的成熟，从而与其体内对应物高度相似。整合的小胶质细胞存活超过6个月，并表现出成熟的形态、功能和基因表达。重要的是，当被工程化以模拟阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）病理时，3BTM 再现了关键疾病特征，包括淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）沉积、磷酸化tau（phospho-tau, p-tau）水平升高和神经炎症，小胶质细胞将其转录组（transcriptome）转向疾病相关特征。使用抗Aβ免疫疗法（anti-Aβ immunotherapy）处理AD 3BTM 清除了沉积物，并在很大程度上逆转了胶质细胞中的疾病特征。总之，研究人员的小胶质细胞包含模型为研究人脑组织的生理和病理状态提供了一个平台。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
人脑功能与疾病机制的研究依赖于可访问且特征明确的模型系统。目前基于诱导多能干细胞（iPSC）的体外模型，如二维（2D）共培养、三维（3D）水凝胶系统、球状体培养及神经类器官（neural organoids, NOs），虽能生成多种脑细胞类型，但存在显著局限性：2D模型缺乏生理形态、成熟度和细胞间互作；3D模型难以稳定整合成熟且稳态的小胶质细胞（microglia, MG），而MG是维持脑稳态和参与神经退行性疾病的关键免疫细胞。现有模型中小胶质细胞常缺乏成熟表型、快速衰亡或处于非稳态激活状态，且无法复现脑组织特有的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）形成。因此，急需一种高可重复性、支持长期存活与成熟小胶质细胞整合的3D脑组织模型，以研究生理和病理条件下的细胞互作，尤其是阿尔茨海默病（AD）等疾病中的神经炎症机制。
**研究内容与结论**
研究人员开发了一种基于iPSC的3D皮质脑组织模型（3BTM），该模型通过自聚集分化的神经元（iNEs）、星形胶质细胞（iAS）和小胶质细胞（iMGs）形成，避免了人工ECM，具有高可重复性。3BTM可在无增殖和坏死核心形成的情况下维持数月，所有细胞类型均表现出形态、功能及蛋白质组水平的成熟，与体内脑组织高度相似。整合的iMGs存活超过6个月，呈现分枝状形态并表达稳态标志物P2RY12，能对局灶性激光损伤做出快速反应。通过CRISPR–Cas9敲入协同APP突变，研究人员建立了AD模型，再现了Aβ沉积、p-tau升高、神经炎症及疾病相关小胶质细胞转录组特征。使用抗Aβ免疫疗法（aducanumab）可清除Aβ沉积并逆转胶质细胞中的疾病信号。该模型为研究人类脑组织的生理和病理状态提供了平台，论文发表于《Nature Neuroscience》。
**主要关键技术与方法**
1. **iPSC分化与3BTM构建**：采用小分子引导的2D分化方案分别获得纯化的iNEs、iAS和iMGs，随后在超低吸附板中自聚集形成3D结构，避免使用Matrigel等人工ECM，并通过DAPT和5-氟尿嘧啶（5FU）处理抑制增殖、防止坏死核心形成。
2. **多组学分析**：利用质谱（MS）蛋白质组学、单细胞RNA测序（scRNA-seq）及电生理学（patch-clamp）评估细胞成熟度、功能及疾病表型；样本来源包括人胎脑（gestational week 15–17）和幼年人脑（6岁）作为对照。
3. **疾病模型构建**：通过CRISPR–Cas9将APP Swedish、Arctic和Iberian突变（NLGF）敲入iPSC，建立等基因AD模型；使用外源性合成Aβ42诱导淀粉样斑块样病理，并测试抗Aβ抗体（aducanumab）的疗效。
**研究结果**
**1. 生成含稳态小胶质细胞的可重复人3D脑组织模型**
通过优化2D分化方案获得高纯度iNEs、iAS和iMGs，按3:1（iNE:iAS）比例自聚集形成直径约800 μm的球状结构，经DAPT和5FU处理后直径稳定数月，无坏死核心。iMGs加入后自主迁移并均匀分布，在6个月内逐渐呈现分枝状形态，超过75%的细胞表达稳态标志物P2RY12。双光子成像显示，iMGs对局灶性激光损伤能迅速伸出突起并包裹损伤区域，表现出与体内类似的反应速度和功能。三种iPSC系（SA2、A18、KOLF）均验证了可重复性。
**2. 3BTM的成熟提高与人脑组织的相似性**
蛋白质组学主成分分析（PCA）显示，3BTM随培养时间（3天、3个月、6个月）向人胎脑和幼年脑方向移动，与NOs明显分离。电镜观察到突触结构（包括三突触）、免疫荧光显示突触蛋白（Syn1、PSD95）共定位增加。ECM成分（如透明质酸、神经聚糖、聚集蛋白聚糖等）随时间显著上调，星形胶质细胞成熟标志物（如AQP4）表达升高，细胞周期蛋白下调。三种iPSC系间蛋白质组高度相关，变化趋势一致，表明3BTM中细胞逐步成熟，接近体内脑组织。
**3. iMGs在3BTM中成熟并获得类似人脑的转录组特征**
scRNA-seq分析显示，iMGs在1个月和3个月时主要分为静息、趋化因子相关、增殖和糖酵解等亚群，3个月时上调敏感受体（sensome）基因和免疫监视相关通路，早期激活标志物减少。与胎儿和产后人脑MG数据集整合后，3个月iMGs更接近产后MG，且富集成人MG特征。跨iPSC系验证了iMG成熟标志物（P2RY12、P2RY13）的稳定表达和敏感受体特征增强。
**4. 3BTM中iNEs、iAS和iMGs获得成熟脑细胞典型功能**
电生理记录显示iNEs产生自发和诱发的动作电位，静息膜电位约?65 mV，对河豚毒素敏感，呈现异质性放电模式。钙成像检测到自发同步网络活动。iAS在炎症因子刺激下上调NFκB、C3、SERPIN3A等反应性标志物。iMGs持续监测环境，吞噬死亡细胞核和突触物质，并具有损伤响应能力。
**5. 与2D共培养相比，3BTM中脑细胞成熟度、稳态和功能更高**
scRNA-seq和蛋白质组学对比显示，3BTM中iNEs的突触组织、轴突发育相关基因表达更高，网络活动同步性增强；iAS的运动能力、纤毛组织相关基因上调，稳态标志物（如SLC2A1、MT3）表达更高，形态更复杂；iMGs的免疫激活基因下调，稳态标志物（P2RY12、P2RY13）上调，分枝更多，对损伤反应更灵敏。ECM成分（如BCAN、NCAN）在3BTM中显著升高。
**6. CRISPR–Cas9介导的协同APP突变插入以模拟AD**
在SA2 iPSC中敲入NLGF突变（Swedish、Arctic、Iberian），生成等基因AD模型。成功编辑的iPSC系经Sanger测序、指纹图谱、分子核型分析和脱靶检测验证，保持未分化状态和基因组完整性。
**7. AD模型3BTM再现核心AD表型**
敲入3BTM中总Aβ水平升高约4倍，Aβ42:40比例升高约50倍，Aβ聚集体逐渐积累，可被BACE抑制剂IV阻断。iAS和iMGs的存在增加Aβ沉积。1个月时即可检测到不溶性Aβ42，6个月时增加。p-tau181（AT270）和PHF-1（p-tau396/404）水平在敲入3BTM中升高，且需要iMGs和iAS的存在。
**8. AD模型3BTM中小胶质细胞再现疾病相关变化**
qPCR显示NFκB、CD68、C3、C1QC表达升高。scRNA-seq鉴定出两个基因型特异性小胶质细胞簇（KI cluster 1和2），上调TREM2、CD14、PSAP等AD风险基因，富集免疫反应、趋化性通路，下调抗原呈递通路。AD风险基因（BLNK、SORL1）特异性上调。KI cluster 2显著富集人AD脑MG特征，与Zhou et al. (2020) 的AD MG特征重叠。
**9. iMGs、iNEs和iAS在多个细胞系中显示可重复的AD相关变化**
在A18和SA2敲入系中，scRNA-seq确认iMG的AD特征（如免疫激活）一致上调。iNEs中内质网应激、未折叠蛋白反应和衰老相关基因上调，突触相关通路下调。iAS中糖酵解上调、氧化磷酸化下调，ECM相关通路下调。蛋白质组学验证了代谢转换、突触缺陷和ECM下调。
**10. 3BTM可用于研究AD相关扰动和药物反应**
外源性Aβ42（sAβ42）处理形成致密核心斑块样结构（pFTAA阳性），iMGs吞噬Aβ。aducanumab处理2周后Aβ负荷降低，1个月后降低更显著，且Aβ与aducanumab共定位于iMGs内，CD68表达升高。scRNA-seq和蛋白质组学显示，aducanumab可逆转sAβ42诱导的ECM、溶酶体、金属离子稳态失调，上调吞噬和MHC蛋白复合体通路，下调内质网应激和凋亡信号，提示积极治疗反应。
**讨论与结论**
3BTM克服了现有模型缺乏可重复性、增殖坏死核心、小胶质细胞稳态维持等缺陷，首次实现iMGs长期存活、P2RY12膜表达和分枝形态，并模拟了AD相关病理（Aβ沉积、p-tau升高、神经炎症）及小胶质细胞疾病转录组变化。该模型模块化特性允许不同细胞类型和基因型组合，适用于药物筛选和细胞互作研究。研究结论部分翻译如下：总之，3BTM构成了一个完全基于干细胞的人皮质组织模型，能够分析神经元和胶质细胞（包括稳态小胶质细胞），研究其在生理和病理条件下的相互作用，并适用于药物开发。
