《International Journal of Molecular Sciences》：Hypophosphatasia: Results of a Country-Wide Selective Screening Program Using NGS Technology as a First-Tier Test
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低磷酸酯酶症（HPP）是一种罕见的遗传性代谢障碍，由ALPL基因的核苷酸变异引起，导致组织非特异性碱性磷酸酶（TNSALP）缺乏。HPP具有可变的临床表现（例如骨骼和牙齿矿化受损、呼吸功能障碍、肌肉无力、肌肉和骨骼疼痛、生长缺陷、肾钙质沉着症、癫痫发作、脑病、
低磷酸酯酶症（HPP）是一种罕见的遗传性代谢障碍，由ALPL基因的核苷酸变异引起，导致组织非特异性碱性磷酸酶（TNSALP）缺乏。HPP具有可变的临床表现（例如骨骼和牙齿矿化受损、呼吸功能障碍、肌肉无力、肌肉和骨骼疼痛、生长缺陷、肾钙质沉着症、癫痫发作、脑病、颅内高压和智力障碍），与其他疾病重叠，通常会导致正确的诊断延迟。在这项研究中，研究人员展示了一项在俄罗斯于2022–2026年期间开展的双中心（莫斯科和圣彼得堡）选择性筛查项目的结果，该项目基于对4912名疑似HPP患者进行的下一代测序（NGS）。每个中心使用了其自己的NGS基因组合。在莫斯科，9.5%的患者发现了ALPL中的致病因核苷酸变异，并在9.8%的患者中发现了组合中其他基因的变异。筛查的选择标准在研究过程中不断演变，从而提高了诊断产出率。在圣彼得堡，3.5%的患者发现了ALPL中的致病性变异。最常见的ALPL变异是c.571G>A（28%），这与它在北欧的奠基者效应相一致。在鉴别诊断组合中，致病性或可能致病性的变异最常见于COL1A2、COL1A1和CASR基因，突显了HPP与成骨不全症（OI）及相关疾病的表型重叠，并强调了靶向NGS在解决HPP诊断不确定性方面的价值。总体而言，这项研究提供了迄今为止俄罗斯人群中关于HPP遗传学的最全面数据。
低磷酸酯酶症是一种罕见的遗传性代谢疾病，主要由组织非特异性碱性磷酸酶（TNSALP，一种在骨骼和牙齿矿化中起关键作用的酶）缺乏或功能障碍引起，其根源在于ALPL基因中存在致病性核苷酸变异。HPP的临床表现极其多样，从轻微的牙齿早脱落、肌肉无力到严重的呼吸功能障碍、癫痫发作甚至危及生命的骨骼矿化严重受损，且这些症状常与其他骨骼 mineralization 疾病重叠，导致患者常经历漫长的“诊断奥德赛”，延误了针对该病的酶替代疗法（ERT）等病因治疗的实施。鉴于HPP的复杂性和低确诊率，开发全面、高效的分子诊断策略迫在眉睫。在此背景下，研究人员在俄罗斯开展了一项覆盖多中心、基于下一代测序（NGS）技术的大规模选择性筛查项目，旨在探究俄罗斯人群中HPP的遗传学特征，并评估靶向NGS作为一线测试在HPP及其鉴别诊断中的临床应用价值。
为开展此项研究，研究人员主要依赖于针对骨骼矿化相关基因组设计的靶向NGS技术方法。研究分为两个独立队列：莫斯科队列包含3121例患者，使用涵盖ALPL全序列及56个骨矿化相关鉴别诊断基因的组合进行靶向测序；圣彼得堡队列包含1791例患者，使用包含ALPL及103个单基因疾病基因的panel。患者入组选择标准随研究推进不断改进。通过提取样本DNA、构建测序文库和 Illumina 平台测序，研究人员按照美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）指南对变异进行评级注释，并结合Sanger测序对特定变异进行家系验证。
**实验工作流程**
研究共招募了4912名来自俄罗斯各地的疑似HPP患者，其中莫斯科队列的中位年龄为12岁，圣彼得堡队列为9岁。两个队列结合构成了该国迄今最大规模的HPP相关临床筛查数据集。
**NGS分析**
通过对莫斯科队列的NGS数据分析，研究人员发现9.45%的患者携带ALPL基因变异，9.77%携带panel中其他基因变异。筛查项目的阳性率呈现阶段性上升特征，从第一阶段的3.3%提升至第三阶段的12.2%，这种提升归因于选择标准的优化，特别是严格引入了依据年龄和性别调整的碱性磷酸酶（ALP）参考范围作为入组标准。在圣彼得堡队列中，ALPL基因致病变异的检出率为3.5%，相对较低的表现与该队列早期入组标准缺乏特异性相关。在全部4912名患者中，研究发现最高频的变异是c.571G>A，印证了其在北欧人群中的奠基者效应特点。在非ALPL基因变异中，主要集中分布于COL1A2、COL1A1以及CASR等基因，揭示了大量疑似HPP患者实为成骨不全症（OI）等疾病患者。
**讨论**
在讨论部分，研究人员深入分析了选择性筛查标准对阳性检出率的关键影响，强调采用经过年龄和性别验证的标准化ALP生化水平作为入组条件能有效剔除假阳性患者，提高确诊效率。针对变异特征，研究发现鉴定出的致病新变异亟需后续系统性的临床功能评估以验证其实际影响。在HPP的遗传学特征中，尤为重要的一项发现是关于伴有显性负效应（DNE，指突变蛋白通过干扰野生型蛋白的正常功能而导致酶活性大幅下降）的ALPL基因变异。在这项研究中，确定了19个具有既定DNE的致病变异。证实DNE的存在不仅能更精准地预测临床病程严重性，对于指导治疗策略的制定也具有决定性意义。
许多患者虽有持续降低的ALP活性，却并没有在ALPL基因筛查中发现致病性变异，这提示在ALPL“之外”可能存在寡基因遗传机制。除了 klasik ALPL 之外，基因panel鉴定出疑似HPP患者频繁携带 COL1A1 和 COL1A2 基因变异。成骨不全症等疾病由于会导致成骨细胞内质网应激及功能受损，亦会引起继发性的 TNSALP 表达下降和 ALP 活性低下，从而造成临床和生化特征上的显著重叠。因此，利用靶向大panel测序对这组疾病进行精准鉴别显得尤为关键。研究亦发现 CASR 等基因变异可通过干扰钙稳态表现出类似HPP的肾钙质沉着症等症状，但其致病机制则完全不同。
**研究结论**
本研究通过在俄罗斯人群中实施大规模国别NGS选择性筛查，提供了迄今最为详尽的HPP遗传学图谱。研究证明，将靶向NGS技术作为一线筛查工具不仅能够高效确诊HPP患者，还能为近10%因症状重叠而长期被误诊的骨骼矿化障碍患者提供确切的分子诊断，从而结束他们漫长的“诊断奥德赛”。这一策略的实施加深了研究人员对儿科骨骼疾病遗传学基础的理解，为临床实现明智的医疗决策和患者个体化治疗铺平了道路。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
