综述：单链可变区片段融合蛋白用于靶向递送和治疗

《Pharmaceuticals》：Single-Chain Variable Fragment Fusion Proteins for Targeted Delivery and Therapy

　　

单链可变区片段（scFv）是一种工程化抗体衍生物，其保留了抗原结合特异性，同时比抗体小得多，具有更好的组织穿透性和更强的基因操作多功能性。当scFv与多种蛋白质有效载荷融合时，可以产生多功能生物制剂用于靶向递送和治疗。在过去十年中，scFv融合蛋白在肿瘤学领域获得了显著关注，已被整合到免疫毒素（immunotoxins）、免疫细胞因子（immunocytokines）、双特异性抗体（bispecific antibodies）、嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）-T细胞构建体和免疫细胞接合器（immune cell engagers）中。此外，血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）靶向策略的进展使得基于scFv的治疗方法能够探索神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病和帕金森病。尽管临床前和临床结果令人鼓舞，但结构不稳定性、半衰期短、免疫原性和制造复杂性等挑战仍然存在。本综述提供了scFv融合蛋白工程及其在癌症和神经退行性疾病中治疗应用的深入且最新的概述。研究人员还强调了scFv融合蛋白的临床转化和设计原则。

引言（Introduction）：靶向治疗从根本上重塑了疾病治疗范式，尤其在肿瘤学和慢性神经系统疾病中。单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）虽处于前沿，但存在结构限制：分子量约150 kDa，难以穿透实体瘤致密细胞外基质；且体积庞大、缺乏特异性转运机制，无法跨越血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）、血视网膜屏障（blood–retinal barrier, BRB）及黏膜屏障等生理屏障。单链可变区片段（scFv）是1988年首次描述的抗体片段格式，由抗体的重链可变区（variable heavy, VH）和轻链可变区（variable light, VL）通过柔性肽接头（通常为富含甘氨酸和丝氨酸的15–20氨基酸序列）连接而成，分子量约25–30 kDa（约为全长mAb的五分之一），保留关键的抗原结合亲和力。这种质量缩减改善了向致密肿瘤块的扩散，并增强了穿透限制性生理屏障的潜力。scFv可在微生物系统（如大肠杆菌Escherichia coli）中高效表达，成为开发多特异性蛋白、放射免疫偶联物及嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）-T细胞疗法靶向组分的成本效益平台。通过多聚化技术，scFv可产生二聚体（diabodies，~50–60 kDa）、三聚体（triabodies，~75–90 kDa）和四聚体（tetrabodies，~100–120 kDa）。scFv的模块化架构允许两个抗原结合单元串联组装，如双特异性T细胞接合器（bispecific T-cell engagers, BiTEs），其中两个scFv连接以同时靶向肿瘤相关抗原和免疫细胞。纳米抗体（nanobody，或单域抗体single-domain antibody）是15 kDa的抗体片段，源自骆驼科动物天然存在的重链-only抗体，代表最小的抗原结合实体。尽管全长IgG单克隆抗体仍是治疗性生物制剂的主导类别，但抗体片段和工程化多特异性格式的发展扩展了可用靶向策略的范围。scFv融合蛋白通过将scFv与毒素、细胞因子或酶融合，可创建精确武器。在肿瘤学中，scFv用于构建免疫毒素（向恶性细胞直接递送致命攻击）、CAR-T细胞构建体以及双特异性T细胞接合器（BiTEs）。在神经退行性疾病中，scFv可融合转运载体，劫持受体介导的转胞吞途径，将治疗性酶或蛋白聚集抑制剂运过BBB。本综述全面分析scFv融合蛋白，涵盖结构设计、工程策略、治疗应用及塑造该领域的新兴技术，概述了指导其成功的一般工程原则（如接头设计、稳定性优化、半衰期延长、免疫原性降低和BBB转运），并审视了在肿瘤学和神经疾病中已获批临床疗法及晚期临床候选药物。

结构和工程化（Structure and Engineering of scFv Fusion Proteins）：
分子架构（Molecular Architecture）：scFv的分子架构由抗体的VH和VL域通过柔性肽接头连接而成。接头设计是折叠、特异性和溶解性的关键决定因素，最普遍序列为(Gly₄Ser)₃基序，提供高柔性和低免疫原性。甘氨酸提供构象自由度，丝氨酸贡献溶解度。15个氨基酸的接头长度（约3.5 nm）被认为是金标准，允许域间非共价配对而不施加空间应变。结构完整性取决于VH和VL域精确的非共价配对，形成由六个互补决定区（complementarity-determining regions, CDRs）定义的抗原结合位点（paratope）。域取向（VH-linker-VL或VL-linker-VH）显著影响微生物宿主中的表达产量和最终结合亲和力（K_D）。不正确折叠的scFv易暴露疏水内部残基，导致不可逆聚集和功能丧失。
融合模式（Fusion Modalities）：scFv可与多种功能模块融合。例如，scFv可作为免疫毒素的靶向模块，通过基因融合细菌来源毒素（如假单胞菌外毒素A或白喉毒素），识别恶性细胞表面抗原，触发受体介导的内吞，毒素部分逃逸内体进入胞质，通过ADP-核糖基化延伸因子2抑制蛋白质合成。当前研究聚焦于最小化这些外源蛋白域的内在免疫原性。scFv还常作为免疫细胞因子，与强效信号分子（如白细胞介素-2 Interleukin-2, IL-2或干扰素-α Interferon-alpha, IFN-α）融合，将细胞因子递送至肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），局部富集激活肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）和自然杀伤（natural killer, NK）细胞，从而扩大治疗窗口、减少细胞因子风暴。scFv的模块化还用于抗体导向酶前药治疗（antibody-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT），其中scFv与酶（如β-内酰胺酶或羧肽酶）融合，首先导航至肿瘤，随后系统给药无毒性前药，酶在肿瘤附近催化前药转化为高细胞毒性药物，实现空间控制。scFv支架还用于递送神经保护性抗淀粉样蛋白治疗抗体，通过靶向BBB上高表达的转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR），scFv作为转运载体，引发转胞吞将治疗性蛋白运入脑内。例如，抗TfR scFv与抗Aβ抗体mAb158融合增强了BBB转运和脑暴露，改善了阿尔茨海默病模型中可溶性Aβ原纤维的减少；抗TfR scFv与抗α-突触核蛋白抗体RmAb38E2-scFv8D3融合增强脑递送、减少致病性α-突触核蛋白寡聚体水平并改善小胶质细胞活化。治疗性神经保护酶也已通过TfR介导的BBB转运策略递送，如pabinafusp alfa（IZCARGO?），一种抗TfR抗体–艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（iduronate-2-sulfatase, IDS）融合蛋白，在日本获批用于治疗黏多糖贮积症Ⅱ型（Hunter综合征）的躯体及神经症状。
表达平台（Expression Platforms）：scFv融合蛋白可使用重组蛋白制备的标准技术表达和纯化。大肠杆菌（E. coli）因快速生长动力学和低成本仍是初始筛选和大规模生产的首选，但缺乏翻译后修饰，蛋白质常积聚于不溶性包涵体，需困难复性过程。酵母表达系统提供真核生物优势，可直接分泌蛋白至培养基中，简化纯化，并形成比细菌更优的二硫键。对于需要天然类人折叠和精确翻译后修饰的临床应用，哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO）细胞是金标准，确保糖基化和折叠与天然人类抗体几乎一致。无细胞蛋白合成（cell-free protein synthesis, CFPS）提供成本效益策略，利用粗细胞提取物在受控化学环境中快速产生蛋白质，可生产对活宿主细胞有毒的payloads。

癌症治疗应用（Applications for Cancer Therapy）：
靶向细胞毒性（Targeted Cytotoxicity）：scFv与致命payloads融合时，作为制导导弹将攻击直接递送至恶性细胞。机制始于高亲和力结合特定细胞表面抗原（如乳腺癌中的HER2），然后整个复合物通常通过受体介导的内吞内化。payloads种类广泛，按作用机制分类：细菌或植物毒素（如假单胞菌外毒素或蓖麻毒素）进入胞质后催化性灭活蛋白质合成，导致快速细胞凋亡；促凋亡蛋白（如颗粒酶B Granzyme B或各种caspase）可直接触发细胞内部自我毁灭程序。例如，抗HER2 scFv与蛋白质合成抑制剂gelonin融合抑制小鼠乳腺癌异种移植瘤生长；Hutt等人构建了连接促凋亡TRAIL与靶向EGFR或HER3的scFv的融合蛋白，在异种移植肿瘤模型中实现强效抗肿瘤活性；抗HER2 scFv与细胞色素c融合诱导HER2过表达乳腺癌细胞凋亡；抗CD22 scFv与促凋亡蛋白Bim融合有效诱导恶性B细胞凋亡；双重靶向治疗系统（间充质干细胞工程化产生并递送scFv-Fdt-tBid）显著抑制体内前列腺癌生长。
肿瘤微环境靶向（Tumor Microenvironment Targeting）：scFv融合蛋白可通过局部递送细胞因子或检查点抑制剂来调节肿瘤微环境（TME）。scFv-细胞因子融合物（免疫细胞因子）的治疗潜力在于将强效免疫调节信号直接浓缩于TME内。系统给药IL-2、IL-12或TNF-α常受限于严重细胞因子风暴毒性，但通过锚定至靶向肿瘤相关抗原（如癌胚抗原carcinoembryonic antigen, CEA或成纤维细胞激活蛋白Fibroblast Activation Protein, FAP）的scFv，细胞因子剂量被隔离于肿瘤部位。这种局部富集将TME从“免疫冷”（抑制性）状态转变为“热”（活性）状态，刺激NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）的浸润和激活。例如，Halin等人构建了IL-12与靶向纤连蛋白ED-B域scFv的融合蛋白，在小鼠肺转移模型中实现强效抗肿瘤活性；Xu等人工程化了靶向CEA的scFv与IL-2的融合蛋白，在荷MC-38肿瘤小鼠中表现出优异抗肿瘤活性。此外，scFv可工程化以局部递送检查点抑制剂或共刺激分子，如Tzuri等人创建了DuRan-Bis，包含基于scFv的PD-L1抑制剂融合基于scFv的VEGF抑制剂，对胶质母细胞瘤细胞增殖表现出优越抑制。
酶介导治疗（Enzyme-Mediated Therapy）：scFv-酶融合物通过ADEPT在靶位点将无活性前药转化为活性细胞毒性药物。ADEPT最大化强效细胞毒性药物的治疗指数：首先给药scFv-酶融合蛋白，scFv结合肿瘤细胞表面抗原并将酶锚定于肿瘤内；待融合蛋白从体循环清除后，给药无毒性前药，前药到达肿瘤时被酶转化为活性致死形式，产生高浓度药物于需要部位，减少全身毒性。例如，抗CEA scFv与细菌酶羧肽酶G2（carboxypeptidase G2, CPG2）融合，裂解芥子基前药，活性芥子药物交叉连接肿瘤细胞DNA诱导快速细胞死亡；抗TAG-72 scFv与β-内酰胺酶融合，激活新型前药GC-Mel，在结直肠异种移植肿瘤模型中显示显著疗效；抗A33 scFv与胞嘧啶脱氨酶（Cytosine Deaminase, CD）融合，将5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine, 5-FC）转化为强效化疗药5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU），常用于治疗结肠癌。
双特异性T细胞接合器（Bispecific T-Cell Engagers, BiTEs）：BiTE由两个scFv（抗CD3和抗肿瘤相关抗原TAA）通过短柔性接头连接而成。BiTE机制依赖scFv同时结合T细胞和肿瘤细胞，强制形成细胞溶解突触，触发T细胞活化，释放穿孔素和颗粒酶，诱导靶癌细胞凋亡。例如，blinatumomab（首个FDA批准的BiTE）靶向B细胞前体急性淋巴细胞白血病（ALL）上的CD19，彻底改变了微小残留病变患者的治疗；tebentafusp（靶向glycoprotein 100和CD3的BiTE）用于葡萄膜黑色素瘤，证明该技术可应用于实体瘤治疗。

神经退行性疾病应用（Applications for Neurodegenerative Diseases）：
血脑屏障靶向（Blood–Brain Barrier Targeting）：BBB是CNS治疗的主要障碍。scFv通过靶向内源性转运系统（特别是受体介导的转胞吞）携带治疗蛋白穿越BBB。通过结合脑微血管上高表达的受体（如TfR或胰岛素受体insulin receptor, IR），scFv构建体劫持用于必需营养物的天然细胞机器。scFv亲和力可精细调节，确保蛋白足够强地结合管腔侧受体以被内化，但到达对侧（脑实质侧）时有效释放。例如，Hultqvist等人工程化了抗TfR scFv与mAb158（针对Aβ原纤维的抗体）轻链的融合蛋白，导致融合蛋白脑摄取显著增高。研究表明，高亲和力抗TfR抗体与BBB的TfR紧密结合，无法在到达对侧时解离，被捕获于屏障处；而低亲和力抗TfR抗体变体可从BBB释放进入脑。因此，Yu等人设计了双特异性抗体，以低亲和力结合TfR，以高亲和力结合β-分泌酶（将淀粉样前体蛋白加工为Aβ），单次系统给药后在小鼠脑中高积累，脑Aβ减少更显著。
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease）：阿尔茨海默病（AD）以Aβ斑块和细胞内tau神经原纤维缠结的毒性积累为特征。scFv融合蛋白可干预AD进展：通过靶向Aβ的N端或中央疏水核心，scFv构建体物理干扰聚集过程，防止毒性寡聚体形成并减少整体斑块负担。由于scFv可工程化为双价或融合清除促进组件，它们增强大脑清除这些毒素的能力，通常通过重编程小胶质细胞。例如，当Aβ原纤维选择性蛋白mAb158与抗TfR scFv融合时，Syv?nen等人显示小鼠可溶性Aβ原纤维减少40%；相反，Sumbria等人构建了抗淀粉样蛋白scFv与抗小鼠TfR mAb重链羧基末端的融合蛋白，实现皮层和海马中淀粉样斑块分别减少57%和61%。此外，这些融合物正在革新早期诊断成像：通过将抗Aβ或抗tau scFv与对比剂（如PET放射性核素）偶联，临床医生可在临床症状出现前数年可视化AD的分子病理。
帕金森病（Parkinson’s Disease）：帕金森病（PD）的主要病理驱动因素是α-突触核蛋白的错误折叠和聚集，形成不溶性路易小体，导致多巴胺能神经元死亡。基于scFv的构建体可特异性设计靶向α-突触核蛋白的最毒性物种：可溶性寡聚体和原纤维。这些融合蛋白可工程化识别仅在疾病蛋白中存在的独特构象表位，留下正常α-突触核蛋白不受影响，这对维持正常突触功能同时促进病理性聚集物清除至关重要。例如，抗TfR scFv与抗α-突触核蛋白寡聚体抗体RmAb38E2融合，在转基因L61小鼠中减少脑α-突触核蛋白寡聚体水平并增加小胶质细胞活化。An等人工程化了双特异性抗体，由α-突触核蛋白结合免疫球蛋白和胰岛素样生长因子受体1结合scFv组成，在体外和体内结合α-突触核蛋白聚集体并阻止其播种能力。将这些scFv递送入CNS导致神经毒性和神经炎症显著减少；通过中和细胞外α-突触核蛋白，scFv融合物阻止蛋白被邻近健康神经元摄取，从而打破传播循环。

临床转化（Clinical Translation）：
已批准疗法（Approved Therapies）：基于scFv的疗法已从实验概念发展为稳健的临床阶段研究药物或已获批药物，根本上改变了癌症治疗范式。代表药物包括：blinatumomab（Blincyto），属于BiTE类，由两个scFv组成（靶向B细胞上CD19和T细胞上CD3），通过物理桥接这些细胞，强制免疫系统识别并破坏白血病细胞，用于B细胞前体ALL。免疫毒素领域，moxetumomab pasudotox利用抗CD22 scFv与PE38 payload融合，获批用于复发/难治性毛细胞白血病，证明scFv可有效递送致命payloads至耐药癌细胞。
正在进行中的临床试验（Ongoing Clinical Trials）：近期scFv融合蛋白的临床试验显著增加，聚焦实体瘤和神经系统疾病。例如，EGFR靶向免疫毒素（D2C7 scFv与PE38）正在进行复发性恶性胶质瘤成人的I/II期研究（NCT02303678）。VB4-845是靶向上皮细胞粘附分子（EpCAM）的scFv融合蛋白，携带假单胞菌外毒素，已针对头颈癌和膀胱癌进行临床试验。最令人兴奋的前沿是开发针对阿尔茨海默病的BBB穿透性生物制剂：trontinemab是一种双特异性mAb，双价结合Aβ斑块，单价结合人TfR（2+1格式），专门设计通过受体介导的转胞吞穿越BBB。单价TfR结合域旨在防止高亲和力TfR聚集、避免细胞内错误转运，确保trontinemab成功退出内皮细胞进入脑实质。Ib/IIa期结果显示trontinemab快速、高水平的淀粉样斑块清除，且低淀粉样蛋白相关影像异常（amyloid-related imaging abnormalities, ARIAs；脑水肿/出血）率。

挑战与优化（Challenges and Optimizations）：
稳定性工程（Stability Engineering）：scFv比亲本mAb稳定性差，常因暴露先前被恒定域隐藏的疏水斑块而倾向于解折叠或聚集。稳定性工程通过二硫键稳定化（在scFv接头与两个可变域之间引入二硫键）解决此问题，增加热稳定性（T_m）并减少聚集，同时保留结合亲和力和功能。框架优化涉及将不稳定序列换为共识框架，已知其热和化学稳健