Gynura procumbens (Lour.) Merr. 及其活性化合物减轻油酸诱导的肝细胞脂肪变性并调节胆固醇代谢相关基因表达

《Molecules》：Gynura procumbens (Lour.) Merr. and Its Active Compound Attenuate Oleic Acid-Induced Hepatocyte Steatosis and Modulate Cholesterol Metabolism-Related Gene Expression

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）以肝细胞中过量脂质积累为特征，常伴有血脂异常。Gynura procumbens是原产于东南亚的药用植物，具有降脂和保肝特性。然而，其对肝脏脂质积累和胆固醇代谢相关基因调控的影响尚不清楚。本研究评估了G. procumbens提取物（GPCE）和豆甾醇（stigmasterol）对油酸（oleic acid, OA）诱导的肝细胞脂肪变性和胆固醇代谢相关基因表达的影响。研究人员对GPCE进行了HMG-CoA还原酶（HMG-CoA reductase, HMGCR）抑制活性、脂质积累以及胆固醇代谢相关基因（HMGCR、SREBP2、LDLR和PCSK9）表达的评价。通过生物活性导向分离，研究人员鉴定出豆甾醇是高活性组分中的一种成分，并利用液相色谱-飞行时间质谱（LC-TOF-MS）和核磁共振波谱（NMR）对其结构进行了表征。GPCE和豆甾醇分别抑制了86.31 ± 5.3%和56.59 ± 7.6%的HMGCR活性。两种处理均减少了肝细胞中的脂质积累，并调节了所选胆固醇稳态相关基因的mRNA表达，包括转录下调SREBP2和PCSK9。这些发现表明，G. procumbens具有降脂活性，且豆甾醇可能是其观察到的生物学效应的活性成分之一。需要进一步开展蛋白质水平验证、功能分析和体内研究，以充分阐明其机制并确立这些发现在MASLD中的生物学意义。

**论文解读：Gynura procumbens (Lour.) Merr. 及其活性成分豆甾醇减轻油酸诱导的肝细胞脂肪变性并调节胆固醇代谢相关基因表达**

**研究背景与问题**
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球最常见的慢性肝病，患病率约30%，其疾病谱从单纯肝脂肪变性进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），特征为肝细胞脂肪堆积、炎症和纤维化。MASLD的发病机制涉及肝细胞中从头脂肪生成、脂肪酸β-氧化、脂质输出和固醇代谢之间的失衡，导致甘油三酯积累。此外，胆固醇稳态失调（由胆固醇合成、摄取和调控的失衡驱动）也促进MASLD的进展。关键胆固醇代谢相关基因包括固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9），这些基因在维持肝脏胆固醇平衡中起重要作用。

Gynura procumbens（菊科）是一种原产于东南亚（包括马来西亚）的小型绿色草本植物，其提取物具有降糖、抗氧化、抗炎和降血脂活性。该植物含有多种生物活性成分，如酚酸、黄酮类（没食子酸、绿原酸、山奈酚、奎宁酸）和挥发性萜烯（如α-蒎烯和柠檬烯）。其中，反式-对-香豆酸已被证明可减少酒精诱导脂肪肝大鼠模型中的肝脏脂质积累。此外，G. procumbens含有豆甾醇（stigmasterol），因其结构与胆固醇相似，具有调节固醇相关代谢途径的潜力。然而，豆甾醇对肝细胞脂质积累和胆固醇稳态相关基因表达的影响尚不清楚。

尽管已有动物研究显示G. procumbens提取物和豆甾醇可改善酒精或代谢功能障碍驱动的脂肪变性，但关于其对肝细胞胆固醇稳态（尤其在MASLD中）影响的证据仍然有限。是否G. procumbens和豆甾醇能够协调脂质超负荷肝细胞中SREBP2、HMGCR、LDLR和PCSK9等胆固醇相关基因的表达尚不明确。为此，本研究使用人源肝细胞系HepG2（一种研究肝脏脂质代谢和胆固醇调控途径的经典模型），通过油酸（OA）诱导建立肝细胞脂肪变性模型，以评估G. procumbens粗提物（GPCE）和豆甾醇对脂质积累和胆固醇稳态相关基因表达的影响。论文发表在《Molecules》。

**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：
- 体外HMGCR酶活性抑制测定（使用商品化试剂盒，以普伐他汀为阳性对照）
- 细胞活力测定（MTT法）
- 油红O染色及定量分析（评估脂质积累）
- 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测胆固醇代谢相关基因（SREBP2、PCSK9、HMGCR、LDLR）的mRNA表达
- 生物活性导向分离：通过柱层析（硅胶、Sephadex LH-20）和薄层色谱（TLC）对GPCE进行分级分离，获得正己烷（GPHF）、乙酸乙酯（GPEA）和丙酮（GPAF）组分
- 化合物结构鉴定：液相色谱-飞行时间质谱（LC-TOF-MS）和核磁共振波谱（NMR）
- 植物样本来源：G. procumbens采集自马来西亚国民大学植物园（凭证标本UKMB40343）

**研究结果**

**2.1 GPCE及其组分对HMGCR活性的抑制效应**
通过体外HMGCR酶活性测定，GPCE（50 μg/mL）抑制了86.31 ± 5.3%的酶活性。各组分中，正己烷组分（GPHF，25 μg/mL）抑制作用最强（86.28 ± 6.5%），其次为乙酸乙酯组分（GPEA，50 μg/mL，84.72 ± 7.3%），丙酮组分（GPAF，50 μg/mL）抑制作用最弱（63.7 ± 7.5%）。阳性对照普伐他汀（2 μM）抑制率为86.3 ± 18.0%。

**2.2 GPCE及其组分对HepG2细胞活力的影响**
MTT结果显示，GPCE、GPHF、GPEA和GPAF在低浓度（≤25 μg/mL）时维持HepG2细胞活力≥80%。在50 μg/mL时，仅GPHF使细胞活力降至80%以下；而100和200 μg/mL时所有处理均导致细胞活力低于80%。后续实验仅选用维持≥80%细胞活力的浓度。

**2.3 GPCE及其组分对OA诱导的脂质积累和胆固醇调控基因表达的影响**
油红O染色及定量分析显示，GPCE预处理显著减少OA诱导的细胞内脂质积累，GPHF和GPEA也呈现类似降脂效应，而GPAF效果较弱。qRT-PCR检测表明，与OA处理组相比，GPCE、GPHF和GPEA均显著下调SREBP2和PCSK9的mRNA表达；GPAF则无显著抑制作用。

**2.4 从G. procumbens中分离鉴定豆甾醇（化合物1）**
从G. procumbens乙醇叶提取物中分离得到白色无定形粉末（Rf约0.45，正己烷:乙酸乙酯9:1，熔点约162°C）。LC-MS/MS（ESI正离子模式）显示m/z 437.1918 [M+Na]⁺，与豆甾醇（分子量412.70）一致。1H NMR和13C NMR谱图数据与文献报道的豆甾醇匹配，确认化合物1为豆甾醇。

**2.5 豆甾醇对HMGCR活性的抑制效应**
豆甾醇以浓度依赖方式抑制HMGCR活性：2.5 μM时抑制率为32.79 ± 4.36%，5 μM时为56.59 ± 7.61%，均显著高于对照。阳性对照普伐他汀（2 μM）抑制率为80%。

**2.6 豆甾醇对HepG2细胞活力的影响**
豆甾醇在0.875、1.25、2.5 μM浓度下维持细胞活力≥80%，5 μM时仍接近80%阈值；10 μM时细胞活力降至80%以下（p < 0.01）。后续实验选用≤5 μM的浓度。

**2.7 豆甾醇对OA诱导的脂质积累和胆固醇稳态相关基因表达的影响**
油红O染色显示，豆甾醇预处理显著减轻OA诱导的细胞内脂质积累。qRT-PCR结果表明，豆甾醇（5 μM）在6、12、24 h三个时间点均持续下调OA诱导的SREBP2和PCSK9 mRNA表达。对于HMGCR，mRNA表达呈时间依赖性：6 h时显著降低，12和24 h时反而升高（与OA组比较）。LDLR mRNA表达在所有时间点均无显著变化。与阳性对照阿托伐他汀（10 μM）相比，豆甾醇对SREBP2的抑制更持久（24 h仍显著），而阿托伐他汀在24 h时抑制作用消失；阿托伐他汀对PCSK9的抑制在12和24 h显著，但6 h无影响；阿托伐他汀在6 h上调LDLR、12 h下调LDLR，而豆甾醇对LDLR无显著影响。

**总结与讨论**
本研究在OA诱导的HepG2脂肪变性模型中，首次系统评估了G. procumbens提取物（GPCE）及其活性成分豆甾醇对肝细胞脂质积累和胆固醇稳态相关基因（HMGCR、SREBP2、LDLR、PCSK9）表达的影响。结果表明，GPCE及正己烷和乙酸乙酯组分具有强效HMGCR抑制活性，并能减少脂质积累，同时下调SREBP2和PCSK9的mRNA表达。通过生物活性导向分离，研究人员鉴定出豆甾醇是这些活性组分中的一种有效成分，其在无细胞体系中的HMGCR抑制活性（56.59%）虽低于GPCE（86.31%），但在细胞水平上对脂质积累的减轻作用与GPCE相当。进一步基因表达分析显示，豆甾醇持续抑制SREBP2和PCSK9表达，且与阿托伐他汀的瞬时调控模式不同，提示其可能通过影响固醇调控途径发挥作用，而非触发经典的补偿性转录反应。研究还发现豆甾醇对HMGCR mRNA表达呈时间依赖性调控，而对LDLR无显著影响。

**结论（翻译自原文）**
综上所述，G. procumbens提取物表现出强效的HMG-CoA还原酶（HMGCR）抑制活性，减少了油酸（OA）诱导的脂质积累，并与脂肪变性HepG2细胞中特定胆固醇稳态相关基因表达的改变相关联。生物活性导向分离鉴定出豆甾醇（stigmasterol）是促成这些观察到的生物学活性的活性成分之一。总体而言，这些发现支持G. procumbens作为管理MASLD的潜在生物活性化合物来源，并为涉及蛋白质水平验证、功能分析和体内研究的进一步机制研究提供了基础。