《Toxins》：Identification and Detection of Aflatoxigenic Aspergillus flavus and Aflatoxins: Current Technologies and Future Perspectives
黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种主要真菌物种，可污染多种作物并在适宜环境条件下产生黄曲霉毒素（aflatoxins, AFs）。研究人员已开发出多种方法用于产黄曲霉毒素的黄曲霉（aflatoxigenic A. flavus）鉴定和黄曲霉毒素检测。本综述总结了现有产黄曲霉毒素黄曲霉鉴定方法以及黄曲霉毒素检测方法的最新进展，同时指出了准确鉴定产黄曲霉毒素分离株的局限性及相关可能因素。特别地，本综述强调了利用先进分析或检测方法结合现有鉴定技术来准确识别产黄曲霉毒素黄曲霉。
3. 传统方法/培养技术（Traditional Approaches/Cultural Techniques）
形态学鉴定是检测黄曲霉（Aspergillus flavus）等真菌病原体最早期且广泛使用的方法，依赖菌落形态、生长模式、色素产生、菌丝结构和分生孢子形成等可观察特征。研究者使用不同培养基进行培养，如黄曲霉和寄生曲霉琼脂（AFPA）、产黄曲霉毒素能力培养基（APA）、椰子基培养基（CMA、CEA、CCA）、查氏酵母提取物琼脂（CYA）和酵母提取物蔗糖（YES）培养基。然而，形态学方法存在局限性，包括耗时、需专业真菌学知识，且由于曲霉属（Aspergillus）种内和种间存在显著变异，无法可靠区分产毒与非产毒菌株。
3.1. 氨蒸气试验（Ammonia Vapor Test）
氨蒸气试验是一种快速、低成本的传统方法，用于区分产黄曲霉毒素与非产黄曲霉毒素的黄曲霉分离株。将培养物暴露于氢氧化铵蒸气后，菌落颜色变化与黄曲霉毒素（AFs）相关色素（如averantin、norsolorinic acid、averufin、versicolorin A等）的pH敏感性有关。该方法为定性筛查工具，但受培养时间、培养基成分和色素可用性影响，结果变异大，无法提供定量信息。
3.2. 荧光检测（Fluorescent-Based Detection）
荧光检测依赖于在紫外光（365 nm）下，产黄曲霉毒素菌落在固体或液体培养基（如马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、椰子琼脂培养基（CAM））上发出蓝至蓝绿色荧光。添加环糊精和碘等物质可增强荧光强度。该方法虽简单经济，但荧光强度受培养基、环境条件和生长阶段影响，无法定量，且可能导致误判。
3.3. 培养方法的局限性与分子方法的必要性
培养方法成本低、操作简单，但缺乏敏感性、特异性和重复性。黄曲霉毒素（AFs）产生受营养、pH、温度、氧化应激等多因素影响。因此，培养方法仅适用于初步筛查，需借助分子方法提高准确性。
4. 黄曲霉毒素生物合成基因簇（AFs Biosynthesis Gene Cluster）
黄曲霉毒素生物合成基因簇位于黄曲霉（A. flavus）3号染色体端粒区域，大小约70 kb，包含大量结构基因和调控基因。该簇编码至少27种酶促反应，涉及聚酮途径。主要调控因子为aflR（Gal4家族转录激活因子）和aflS（共激活因子）；aflS表达与黄曲霉毒素（AFs）产生关联更紧密。此外，bZIP蛋白（如atfA和atfB）通过响应氧化应激和环境信号影响毒素产生。
4.1. 黄曲霉毒素生物合成阶段（Stages of AFs Biosynthesis）
途径分为四个主要阶段：阶段1：乙酸转化为第一个稳定中间体去甲氧基柄曲霉素（norsolorinic acid, NOR），由aflA、aflB、aflC、hypC等基因介导；阶段2：NOR转化为杂色曲霉毒素A（versicolorin A, VERA），涉及aflD、aflG、aflH、aflK等基因；阶段3：VERA转化为柄曲霉素（sterigmatocystin, ST），由aflM、aflN、aflY、aflX、aflO等基因催化；阶段4：ST最终转化为黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1），涉及aflP、aflQ、hypB、aflE、hypE等基因。最后阶段的基因直接贡献于毒素产生。
4.2. 调控与环境影响（Regulation and Environmental Influence）
黄曲霉毒素（AFs）生物合成不仅取决于基因存在，还受温度、CO
2浓度、营养、氧化应激和发育阶段等环境因素强烈影响。营养丰富促进毒素产生，营养限制则抑制；氧化应激通过转录因子atfA和atfB调控基因表达。
4.3. 对检测的启示（Implications for Detection）
尽管黄曲霉毒素生物合成基因的存在常作为产毒菌株的标记，但不能保证毒素产生。基因调控的复杂性和环境因素使得仅凭基因存在难以准确预测毒素产生，因此需综合基因存在、表达和环境因素进行鉴定。
5. 现有分子方法及其潜在缺陷（Existing Molecular Methods and Potential Drawbacks）
分子检测方法如聚合酶链式反应（PCR）、实时定量PCR（qPCR）、逆转录PCR（RT-PCR）、多重PCR和环介导等温扩增（LAMP）已被广泛采用，具有快速、灵敏、特异等优点。然而，由于基因存在、表达和环境影响的变异，准确分类产毒菌株仍困难。
5.1. PCR
聚合酶链式反应（PCR）通过扩增特异性DNA片段检测黄曲霉（A. flavus），早期使用核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区（ITS）及钙调蛋白（CaM）、β-微管蛋白（BenA）等基因。产毒菌株检测常靶向黄曲霉毒素（AFs）生物合成基因簇中的调控基因（aflR、aflT）和结构基因（aflD、aflM、aflP）。但PCR仅检测基因存在，不提供表达或功能信息，且易因引物错配、突变等产生假阳性或假阴性，缺乏标准化基因集。
5.2. 多重PCR（Multiplex PCR）
多重PCR可同时扩增多个靶基因，提高检测效率。常用基因组合包括nor-1、ver-1、omt-A、apa-2等。但引物相互作用可能降低效率和敏感性，且同样不反映基因表达或毒素产生。
5.3. 逆转录PCR（RT-PCR）
逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）通过将RNA反转录为cDNA评估基因表达，提供基因活性信息。aflQ、aflO、aflD等基因表达与黄曲霉毒素（AFs）积累呈正相关。但表达模式受环境、培养基、培养时间等影响，部分表达基因的菌株可能不产生可检测毒素，导致假阳性，不能独立确认毒素产生。
5.4. 定量PCR（qPCR）
定量聚合酶链式反应（qPCR）可同时检测和定量DNA靶标，灵敏度高，检测限达纳克至飞克级别。但同样主要检测基因存在，基因簇突变或表达变异可导致误判，需结合RT-PCR和毒素定量方法。
5.5. LAMP（环介导等温扩增）检测
环介导等温扩增（LAMP）在恒温条件下快速扩增DNA，适宜现场应用。靶向aflP、aflT、aflD和ITS等基因，灵敏度高（皮克至飞克级）。但可能发生非特异性扩增和交叉反应，低浓度DNA或样品降解导致假阴性，需与其他方法联用。
6. 近期主要侧重于黄曲霉毒素定量的检测技术，但限于产黄曲霉毒素黄曲霉的鉴定
现有黄曲霉毒素（AFs）检测方法包括气相色谱（GC）、薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、荧光偏振分析、酶联免疫吸附测定（ELISA）等，但需专业实验室和人员，成本高，不适合大规模筛查。先进技术如生物传感器和光学检测方法被开发用于快速、灵敏、特异性检测。
6.1. 生物传感器检测（Biosensor-Based Detections）
生物传感器将生物识别元件（DNA、酶、抗体）与信号转换器结合，通过电学、光学或物理信号检测靶标。包括酶传感器、免疫传感器、核酸适配体传感器和固态气体传感器。
6.1.1. 酶传感器（Enzymatic Sensor）
基于底物检测与酶抑制的关联，常用转换器为电化学型。如利用乙酰胆碱酯酶（AChE）受黄曲霉毒素B1（AFB1）抑制的原理检测AFB1；纳米材料可提高稳定性和灵敏度，适用于现场监测。
6.1.2. 免疫传感器（Immunosensor）
基于抗原-抗体相互作用的生物分析装置，包括表面等离子体共振（SPR）、比色传感器和电化学传感器。例如，基于金纳米棒的光学纳米生物传感器检测AFB1，检测限低至0.2 ng/mL；SPR法灵敏度优于ELISA；电化学免疫传感器检测限为0.15 ng/mL。
6.1.3. 核酸适配体传感器（Aptasensors）
利用适配体（单链RNA或DNA，2–60个核苷酸）特异性结合靶标，已开发针对AFB1、赭曲霉毒素A（OTA）、伏马菌素（fumonisin）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和T-2毒素的适配体传感器。基于RT-qPCR的适配体传感器可检测25 fg/mL的AFB1。优点包括高通量、低成本、便携，但适配体选择耗时，且难以区分类似黄曲霉毒素。
6.1.4. 固态气体传感器（Solid-State Gas Sensor）
通过检测产黄曲霉毒素真菌释放的挥发性有机化合物（VOCs）间接检测黄曲霉毒素。VOCs与传感层表面吸附的O
2相互作用产生电信号，纳米颗粒可提高性能。该方法可用于早期非破坏性检测，但受环境因素和非特异性VOCs干扰。
6.2. 光学检测（Optical-Based Detections）
包括荧光光谱（FS）、拉曼光谱、近红外光谱（NIRS）和高光谱成像（HSI），为快速无损方法。
6.2.1. 荧光光谱（Fluorescence Spectroscopy, FS）
基于荧光物质（如黄曲霉毒素）在特定波长激发后发射更长波长光。亮绿黄色荧光（BGYF）与黄曲霉毒素污染相关。激光诱导荧光光谱（LIFS）系统可分类污染样品，检测限5 μg/kg。但曲酸影响荧光信号导致假阳性。荧光指纹图谱（FF）技术提供更灵敏、精确的定量。
6.2.2. 拉曼光谱（Raman Spectroscopy）
基于散射光与化学键相互作用，用于检测食品病原菌和毒素。表面增强拉曼光谱（SERS）利用纳米材料（铜、银、金）增强信号，适用于直接、快速检测黄曲霉毒素，但存在大规模应用、特异性试剂和数据分析等限制，且低浓度分子难以检测。
6.2.3. 近红外光谱（Near-Infrared Spectroscopy, NIRS）
基于样品分子对光的吸收，涉及N-H、O-H、C-H等官能团振动。偏最小二乘回归（PLSR）可区分霉变与健康样品，准确率>88%；傅里叶变换近红外光谱（FT-NIRS）提高准确率至90%以上，甚至100%。
6.2.4. 高光谱成像（Hyperspectral Imaging, HSI）
结合成像与光谱，提供空间和光谱信息，用于真菌感染和黄曲霉毒素（AFs）污染检测。可应用于谷物中镰刀菌和曲霉感染检测，以及早期污染监测。但需减少冗余数据、提高均质样品检测准确性，并优化波长选择。
7. 人工智能与多组学方法在黄曲霉毒素研究中的整合（Integration of Artificial Intelligence and Multi-Omics Approach in Aflatoxins Research）
人工智能（AI）技术用于黄曲霉毒素（AFs）风险预测和检测，如支持向量机、随机森林、梯度提升等机器学习模型，以及长短期记忆网络（LSTM）和卷积神经网络（CNN）可分析时间序列和图像数据，准确率高达90%。多组学方法包括代谢组学（识别化学标记）、基因组学（全基因组测序和基因表达谱）、转录组学（RNA测序研究基因表达和调控）和蛋白质组学（细胞功能和蛋白质谱），为理解黄曲霉毒素产生和真菌感染机制提供深入见解。
8. 结论与未来展望（Conclusions and Future Perspectives）
传统和分子方法虽已发展，但准确鉴定产黄曲霉毒素黄曲霉（aflatoxigenic A. flavus）仍具挑战，因黄曲霉毒素（AFs）生物合成受多基因调控、表达动态和环境条件影响。仅依赖单基因或多基因存在不足以确证产毒能力。未来应开发标准化、多靶标鉴定平台，整合分子、生化、环境参数及先进分析技术。结合生物传感器、便携式测序、基因组学和转录组学等新兴工具，以及基于AI的预测模型、CRISPR-Cas、高光谱成像（HSI）和近红外光谱（NIR），有望提高检测可靠性和食品安全监测效率。
