《Viruses》：Non-Polio Enterovirus A71 and D68 Infection of Human Neuromuscular Organoids Reveals Distinct Mechanisms of Neuromuscular Impairment
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肠道病毒A71 (EV-A71)和肠道病毒D68 (EV-D68)被公认为严重神经系统并发症的致病因子，包括急性弛缓性脊髓炎 (AFM)。然而，介导其神经毒性和对神经肌肉完整性影响的分子机制仍不甚明了。本研究中，研究人员利用人类诱导多能干细胞衍生而来的神经肌肉
肠道病毒A71 (EV-A71)和肠道病毒D68 (EV-D68)被公认为严重神经系统并发症的致病因子，包括急性弛缓性脊髓炎 (AFM)。然而，介导其神经毒性和对神经肌肉完整性影响的分子机制仍不甚明了。本研究中，研究人员利用人类诱导多能干细胞衍生而来的神经肌肉类器官 (NMOs)，在具有人类相关性的背景下探究了EV-A71和EV-D68的细胞嗜性和致病效应。这两种病毒均感染了NMOs内的神经元群体，其中EV-A71表现出较EV-D68更高的病毒复制水平。转录组学分析显示，感染后神经基因网络和肌肉基因网络出现下调。EV-A71优先抑制神经通路，而两种病毒对肌肉相关基因表达产生了类似的影响。这些转录层面的变化突显了调控神经元和肌肉功能及其通讯的通路发生了改变，促使研究人员对突触小泡 machinery 的组成部分进行检验。在蛋白质水平上，两种病毒均与神经元SNARE蛋白，即突触小体相关蛋白25 (SNAP25)的零星切割有关。此外，任意一种病毒的感染均增加了被切割的caspase-3水平，这与细胞凋亡信号传导的激活相一致。综上所述，这些发现表明了病毒特异性的下游效应，并确立了NMOs作为剖析与AFM相关的肠道病毒-宿主相互作用之稳健平台的地位。
肠道病毒属于全球最普遍的人类病原体群体之一，可引发从轻度呼吸道疾病、手足口病 (HFMD) 到心肌炎等一系列临床综合征，并日益成为脑炎、脑膜炎以及急性弛缓性脊髓炎 (AFM) 等严重神经系统并发症的重要诱因，其中AFM会导致严重的肌肉无力与瘫痪。近年来，非脊灰EVs，特别是EV-A71和EV-D68，已成为导致麻痹性病毒神经病变的重要病原体。然而，目前尚无针对这两种病毒的获批抗病毒疗法（中国仅有一种针对EV-A71 C4基因亚群的特异性疫苗）。临床上，EV-A71和EV-D68表现出重叠又截然不同的疾病表现：EV-A71多引发无菌性脑膜炎和脑干脑炎，而EV-D68则强烈关联于通常在呼吸道疾病后暴发的AFM。尽管两者均与人类麻痹性疾病相关，但其潜在的神经肌肉损伤机制是否存在差异尚不清晰。既往的人类死后组织研究和小鼠模型表明，EV-A71具有强嗜神经性，可经逆行转运进入中枢神经系统 (CNS) 感染运动神经元 (MN)；而EV-D68在人类中的特征则是脊髓前角病变和MN丢失。此外，研究还发现仅EV-D68感染会引起严重骨骼肌病变，表明其存在与EV-A71不同的神经肌肉嗜性机制。为解决人类特异性瘫痪机制的问题，亟需在人类相关组织背景下探究这些病毒的致病机制。开展此项研究，不仅有助于理解病毒诱导神经肌肉损伤的病理过程，搭建人类干细胞衍生的多谱系神经肌肉类器官 (NMOs) 平台，以剖析 EV-宿主的相互作用，对开发靶向治疗策略具有重要科学意义与临床价值。该研究成果已发表于《Viruses》。
为开展此项研究，研究人员采用了多种关键技术方法。首先利用人类诱导多能干细胞，将其定向分化培养为包含神经元与肌肉成分的三维多谱系NMOs，并用于后续的病毒感染实验。研究选用的病毒株为EV-A71 C2基因型与EV-D68 Fermon毒株。在样本队列来源方面，NMOs的生成使用了IMR90-4、M001和Gibco? A18945三种不同的hiPSC细胞系。研究人员通过免疫荧光染色、逆转录定量PCR (RT-qPCR) 评估病毒复制动态及滴度；利用转录组测序结合基因集富集分析 (GSEA) 检测宿主基因网络的变化；运用蛋白质印迹法深入研究了关键蛋白的切割情况；使用共聚焦显微镜技术进行细胞定位与空间结构分析。
NMOs重现神经肌肉结构并支持EV-A71和EV-D68感染
研究人员利用三种hiPSC细胞系生成NMOs，免疫荧光染色证实了其内部具有表达β-III-tubulin (TUJ1) 的独立神经元区域以及表达快肌球蛋白重链 的成熟肌肉区域，且神经元能够支配肌肉区域。通过α-银环蛇毒素染色与神经元的共定位，证实了神经肌肉接头 (NMJ) 的形成。随后，NMOs被分别感染EV-A71与EV-D68。RT-qPCR和病毒滴度分析结果表明，两种病毒在感染后病毒RNA拷贝数均随时间显著增加，但EV-A71的复制水平约比EV-D68高出100倍，且其在感染后72小时达到的最终滴度显著高于EV-D68。通过双链RNA (dsRNA) 染色证实，两种病毒的活跃复制主要定位于NMOs的神经元内。结论指出，NMOs具备独立的神经与肌肉空间区域并形成功能性接头，能够支持这两种肠道病毒的感染。
EV-A71和EV-D68差异性下调神经元与肌肉通路
研究人员对感染后的NMOs进行了转录组学分析以评估基因表达变化。主成分分析 (PCA) 结果表明病毒感染是导致转录组变异的主要来源。差异表达基因 分析显示，EV-A71感染引发了更为广泛的转录响应（共1819个DEGs），而EV-D68引发的DEGs较少（共267个）。通过GSEA评估发现，两种病毒感染后均引起了神经和肌肉相关通路的抑制。进一步分析表明，EV-A71主导抑制的是神经元通路，尤其是与突触小泡释放和信号传导相关的通路；而EV-D68对肌肉相关通路起到了更强的抑制效应，主要影响骨骼肌结构与收缩功能等通路。结论表明，EV-A71和EV-D68在NMOs中诱导了截然不同的转录组学改变，导致关键的神经与肌肉通路受抑，揭示了它们引发神经肌肉功能障碍的特异性途径。
EV-A71和EV-D68随机切割SNAP25
基于转录组学中突触通路的下调，研究人员进一步考察了介导神经递质在NMJ释放的SNARE复合体关键蛋白——突触小体相关蛋白25 (SNAP25) 的完整性。免疫荧光证实了SNAP25在NMOs神经元中的表达。蛋白质印迹分析在感染后96小时发现，EV-A71和EV-D68感染均与SNAP25的零星切割有关，且在EV-A71感染的样本中更频繁地检测到切割片段。为了验证这一发现的特异性，研究人员使用已知的SNAP25切割蛋白酶——肉毒杆菌神经毒素A 处理NMOs和hiPSC-MNs，结果证实了SNAP25切割抗体的特异性。结论表明，两种病毒感染均能在NMOs中诱导可检测且发生频率较低的SNAP25切割，提示这可能是肠道病毒破坏突触的一种潜在机制。
EV-A71和EV-D68感染增加被切割的caspase-3水平
转录组数据揭示了凋亡相关通路的富集，研究人员随之探讨了感染对细胞死亡信号的影响。通过检测被切割的caspase-3 (CC3)，发现感染后NMOs中CC3的免疫反应性较对照组有适度增加。虽然神经类器官中常见缺氧相关的细胞死亡，但 staurosporine（一种已知的细胞凋亡诱导剂）处理可适度增加CC3阳性细胞，表明系统对凋亡信号具有敏感性。结论表明，感染EV-A71和EV-D68均伴随着NMOs内caspase-3切割水平的增加，证实了细胞凋亡相关信号的激活。
研究讨论部分总结与结论翻译
本研究确立NMOs作为研究EV感染的生理相关体外模型。转录组学分析表明，EV-A71和EV-D68在转录层面表现出不同的组织嗜性影响：EV-A71强烈下调神经通路，而EV-D68主要影响肌肉通路。这种差异可能与研究中使用了1962年分离的原始EV-D68 Fermon株而非当代与AFM暴发相关的神经组织嗜性流行株有关，该研究存在一定局限性。此外，本研究首次在神经肌肉背景下发现肠道病毒可能靶向切割SNAP25，并与CC3激活相伴随，提示突触破坏与细胞凋亡可能协同加剧神经功能障碍，这可能是导致仅部分受感染个体发生麻痹的潜在分子机制。尽管体外类器官存在批次依赖性且无法完全重现体内复杂性，但它为研究神经元感染与肌肉病变间的相互作用提供了重要平台。未来需通过单细胞RNA测序明确特定细胞亚群的感染动态，并开展电生理与肌肉收缩功能评估以建立分子变化与神经肌肉输出间的功能联系，同时探索病毒蛋白酶在SNAP25切割中的作用，以期为AFM提供更深入的病理机制理解与治疗靶点。最终研究结论指出：EV-A71和EV-D68在NMOs中均能感染神经元群体并诱导病毒复制。感染引发神经元和肌肉基因网络下调，EV-A71主要抑制神经通路，EV-D68主要影响肌肉通路。这两种病毒均引起SNAP25零星切割以及caspase-3依赖性凋亡信号增加，确立了NMOs作为一种稳健平台，用于剖析与AFM相关的肠道病毒-宿主相互作用。
