综述：分子技术在短柄大蚊科分类修订中的应用

《Lubricants》：The Application of Molecular Techniques to Improve the Classification of Limoniidae

　　

Limoniidae是双翅目（Diptera）中物种多样性最高的科，其分类体系长期依赖形态学研究及少数分类学家的主观判断，至今仍未得到妥善解决。分子技术的快速发展为解决长期存在的系统学难题提供了新契机，但目前利用分子数据厘清Limoniidae分类及其近缘类群亲缘关系的研究仍十分有限。本研究系统综述了采用分子方法优化Limoniidae分类、明确其在Tipuloidea中系统发育位置及Tipulomorpha在双翅目系统树中归属的相关文献。检索以“分类”“系统学”“分子”为关键词，通过《世界大蚊名录》文献板块筛选文献，仅纳入针对Limoniidae分类、Tipuloidea内科级系统关系及Tipulomorpha在双翅目中位置开展分子研究的文献。所综述的研究一致支持Limoniidae为非单系群；Tipulomorpha则始终被恢复为单系支系，但其在双翅目中的具体位置仍存在争议，因此尚未建立起令人满意的分类框架。高通量测序技术的发展及大规模分子数据集的构建为解决上述系统学不确定性提供了前所未有的机遇。研究人员主张扩大系统发育分析的分类单元取样规模与遗传标记数量，最终通过研究团队与机构的协同合作，有望成为解决Limoniidae分类与演化关系的有效策略。

1. 1.
   Introduction
   Limoniidae属于长角亚目（Nematocera）蝇类，是双翅目中物种最丰富的类群，已描述物种近11000种。该类群及与其他长角亚目蝇类的亲缘关系至今仍存争议，成虫与幼虫阶段均表现出显著的形态多样性，导致可靠诊断性状与系统发育信息性状的识别难度极大。Limoniidae与大蚊类昆虫亲缘关系密切，后者以身体纤细、足细长为主要鉴别特征，目前公认包含四个主要支系： Cylindrotomidae（长体大蚊）、Limoniidae（短柄大蚊）、Pediciidae（毛大蚊）及Tipulidae（长柄大蚊）。成虫阶段可用于区分这四个支系的形态特征十分有限，Cylindrotomidae雄虫阳茎三分叶、R₁₊₂脉退化并入R₃脉是其典型特征；Limoniidae区别于其他大蚊类的主要特征是末节触须短小，而Tipulidae末节触须较长；Pediciidae的核心鉴别特征为复眼小眼面间具毛。上述类群的高级阶元分类长期不明确，核心争议在于各支系的阶元界定，目前主流分类系统分为两类：单科系统将所有类群归入Tipulidae科，将Limoniinae作为该科下的亚科；四科系统则将各支系独立为科，共同组成Tipuloidea总科，包含Cylindrotomidae、Limoniidae、Pediciidae与Tipulidae。更高阶元层面，大蚊类归入Tipulomorpha下目，除Tipuloidea总科的四个科外，还包括其假定姐妹群Trichoceridae（冬大蚊科）。
   单科系统与四科系统的选择深受分类学家历史地理背景影响。1900年前学者普遍将大蚊归为单一科，19世纪末已有学者依据末节触须长度将Tipulidae划分为Tipulidae longipalpi与Tipulidae brevipalpi两个类群。20世纪初，欧洲昆虫学家开始将Tipulidae brevipalpi独立为科，最初命名为Limnobiidae，后依据Limonia Meigen, 1803属名更正为Limoniidae；而北美学者Charles P. Alexander基于大量分类工作坚持单科系统，其影响力使得多数北美昆虫学家及受Frederick W. Edwards影响的英国学者均采用单科系统。中欧与东欧地区受Lackschewitz、Savchenko及Mannheims等学者的分类研究影响，更广泛接受多科系统。Stary于1992年进一步完善了欧洲学者采用的多元系统，将Pediciinae提升为科级，并将Limoniidae划分为四个亚科，该四科系统后被多数欧洲学者采纳，也是本综述采用的分类框架。
   Stary的分析主要基于其分类经验，定性且存在一定主观性。尽管其研究了系列形态特征，最终认为11个性状可支持Tipulomorpha的单系性，其中Limoniidae的单系性由两个关键共衍征支持：前前胸背板延长且扁平，以及气门下骨片的存在。Tipulomorpha的前胸背板被膜质横背缝分为前后两部分，除Limoniidae外的其他大蚊类群前前胸背板短且呈领状，而Limoniidae的前前胸背板既延长又扁平；此外其他类群的后前胸背板向下延伸呈条带状，旁侧为膜质区域，Limoniidae中该膜质区域部分被骨片替代，Stary将其命名为气门下骨片。这些形态特征在Pediciinae中缺失，成为其从Limoniidae独立为科的依据，加之Pediciidae复眼小眼面间具毛的独特性进一步支持其独立地位。Stary还将Dactylolabis Osten Sacken, 1860属提升为亚科等级，核心依据是该属具肉质生殖刺突，这一特征在其他三个亚科中不存在。然而用于界定Limoniidae亚科的特征，如胫节距的有无、到达翅缘的径脉与中脉数量、基后背板的尺寸、气门下骨片与前胸背板的愈合方式等，在各属中的分布并不一致，使得Stary提出的Limoniidae概念存在缺陷。早在Stary分类系统之前，形态学研究就已质疑Limoniidae的单系性，例如Oosterbroek与Theowald分析了大蚊幼虫与蛹的105个性状，结果显示Limoniidae并非单系群，识别出三个支系：第一支系包含Chioneinae与Limnophiliinae，第二支系为Pediciidae，第三支系包含Limoniinae与未定属，同时支持Cylindrotomidae与Tipulidae为姐妹群。Ribeiro聚焦大蚊类亲缘关系，重点研究Limnophiliinae，提出该亚科是Limoniidae中最古老的支系，尽管其研究证实了Limoniidae的非单系性，但基于仅成虫雄性性状的分析产生了高比例同塑性系统树。目前学界普遍认为现有Limoniidae分类体系不尽人意，很可能与其演化历史不符，但出于实用考量及缺乏可靠的替代假说，多数研究者仍沿用Stary的分类框架。
   分子生物学与生物信息学的快速发展为系统学难题的解决提供了有力工具。目前用于优化Limoniidae分类的分子研究主要聚焦两个问题：一是Limoniidae与Tipulomorpha其他类群的亲缘关系，以及这些类群在双翅目系统树中的位置；二是Limoniidae各亚科间的演化关系，以及这些亚科与其他大蚊亚科的亲缘关系。本综述通过上述问题的文献检索，最终纳入6项探究Limoniidae与Tipulomorpha系统位置的研究，以及8项聚焦Limoniidae分类的研究。
2. 2.
   Classification of Limoniidae Using Molecular Techniques
   2.1. Position of the Limoniidae and Tipulomorpha Within the Diptera
   Friedrich与Tautz于1998年首次开展分子研究探讨Limoniidae及其他大蚊类在双翅目中的系统位置，尽管其核心目标是解析低等双翅目的系统发育。双翅目是全变态昆虫，传统分为两个亚目：长角亚目（Nematocera）触角多节细长，短角亚目（Brachycera）鞭节数减少。学界普遍认为长角亚目为并系群，短角亚目为单系群，意味着传统意义上的长角亚目并非自然演化类群，而是代表不同的演化支系。基于三叠纪与早侏罗世的化石标本，Krzeminski曾提议将双翅目分为四个亚目，但该分类未被现生类群研究者采纳。形态学研究识别出长角亚目内的五个及以上主要支系，通常称为下目，Amorim与Yeates曾提议将这些下目提升为亚目，但由于长角亚目系统发育尚未解决，下目阶元仍为学界首选。不同研究中这些下目的组成与相互关系差异显著，核心难点在于确定双翅目的基部分支及短角亚目的起源类群。形态学研究对大蚊类的位置提出了冲突假说：Hennig与Wood & Borkent将Tipulomorpha置于双翅目最基部分支，而Wood & Borkent基于幼虫性状将Trichoceridae从Tipulomorpha移出，归入Psychodomorpha；Oosterbroek与Courtney则将Tipulomorpha置于更衍生的位置，为Anisopodidae与Brachycera支系的姐妹群。Friedrich与Tautz采用28S rRNA基因片段重新探讨上述问题，仅488 bp序列可准确比对，采用最大简约法、最大似然法与邻接法构建系统树。尽管所有分析均恢复Tipuloidea为单系群（不含Trichoceridae），但主要下目的相对位置在不同树中差异较大，最大似然法下Tipuloidea呈基部位置，邻接法则不然。该研究分类取样极为有限（16个内群物种、3个外群物种），仅包含2种大蚊总科物种与1种毛大蚊科物种，这可能是支持率偏低、关系推断不稳定的主要原因。Bertone等采用多个核基因分析低等双翅目亲缘关系，测序核糖体28S rRNA基因及编码基因CAD（氨甲酰磷酸合成酶2/天冬氨酸转氨甲酰酶/二氢乳清酸酶）、TPI（磷酸丙糖异构酶）、PGD（6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶），比对后排除模糊位点保留5272个字符，采用最大简约法、最大似然法与贝叶斯推断进行系统发育重建。数据集包含64种低等双翅目、3种短角亚目内群、2种长翅目外群与1种蚤目外群。单基因分析产生不一致或分辨率低的系统树，而多基因串联数据集（尤其排除第三位密码子后）得到分辨率更高、拓扑结构更一致的树。所有树均支持Tipulomorpha为单系群，包含Limoniidae、Pediciidae、Cylindrotomidae、Tipulidae与Trichoceridae，但Tipulomorpha在双翅目中既不处于基部也不属于高度衍生位置，大部分系统信号来自28S rRNA而非蛋白编码基因，Deuterophlebiidae意外地被恢复为双翅目最基部分支。Wiegmann等的研究证实了Deuterophlebiidae的基部位置，其分析涵盖约200个物种，代表157个双翅目科中的149个，分两层开展：第一层包含42个物种、14个核基因、完整线粒体基因组及371个形态性状；第二层包含202个分类单元、5个核基因。最大似然与贝叶斯推断均证实Deuterophlebiidae的基部位置，并恢复Tipulomorpha为单系群，位于系统树的基部附近。Zhang等测序了Symplecta hybrida (Meigen, 1804)的完整线粒体基因组，并获取了其他5种Tipuloidea近完整线粒体基因组，与其他双翅目类群的线粒体基因组比较后采用贝叶斯推断重建系统发育，共分析29种双翅目，以2种长翅目、1种蚤目为外群，构建两个数据集：第一个包含13个线粒体蛋白编码基因的第1、2位密码子、2个rRNA基因与19个tRNA基因；第二个因部分蛋白编码基因比对困难，仅包含5个蛋白编码基因的第1、2位密码子、2个rRNA基因与19个tRNA基因。两个数据集产生冲突的系统拓扑，无法明确双翅目最早分化支系或短角亚目起源，但两者均恢复Tipulomorpha为单系群，在双翅目中既不最早分化也不最衍生。Kang等于2017年发表了当时最全面的Tipulomorpha系统发育基因组学研究，组装了1709个单拷贝直系同源基因的数据集，主要来自转录组测序，其中3个转录组为本研究新生成，其余来自公共数据库。采用最大似然法推断系统关系，基于完整直系同源数据集的分析恢复Culicomorpha为双翅目最早分化支系，Bibionomorpha为Brachycera的姐妹群，Tipulomorpha为单系群，位于双翅目系统发育的中间位置，但该结论基于有限的分类取样，仅包含20个内群物种与2个外群物种。近期Zhang等基于线粒体基因组重建了长角亚目蝇类的系统发育，涵盖108种双翅目与8个外群，采用贝叶斯推断对13个蛋白编码基因、2个rRNA基因与22个tRNA基因（共13513 bp）的串联数据集进行分析，再次恢复Deuterophlebiidae为双翅目最基部分支（支持率较低），Tipulomorpha为强支持的单系支系，包含Cylindrotomidae、Limoniidae、Pediciidae、Tipulidae与Trichoceridae，在双翅目中位置偏基，但其与剩余双翅目的关系支持率较低。综上，大蚊类群在双翅目中的位置仍是复杂问题，不同研究结果存在差异，本综述纳入的分类取样最全面的两项研究（Wiegmann等与Zhang等）均支持Tipulomorpha为双翅目较早分化但非最早分化的支系。解析这一高多样性目类的演化历史仍具挑战性，但对理解更广泛的生态与演化格局至关重要，部分双翅目类群的快速辐射可能掩盖了系统发育信号，增加此类类群（如无额缝蝇类）的取样有助于明确Tipulomorpha的位置。

2.2. Test of the Monophyly of the Limoniidae and Analysis of Crane Flies’ Relationships

Limoniidae分类研究普遍聚焦于大蚊科间的亲缘关系或现有亚科的单系性检验。目前Limoniidae分为四个亚科：Chioneinae、Dactylolabinae、Limnophilinae与Limoniinae，但形态分析结果不一致，未能有力支持Limoniidae的单系性，尤其是Limnophilinae的地位存在争议。直接评估大蚊科分类的分子分析较少，且形态与分子研究多倾向于检验现有分类群而非提出新分类体系。Ahonen开展了首项针对Tipuloidea内部关系的分子研究，分析涵盖四个大蚊科亚科水平的亲缘关系，但取样不完整，未包含Tipulidae的Ctenophorinae、Dolichopezinae亚科及Limoniidae的Dactylolabinae亚科。分析采用线粒体COI基因与核EF-1α基因，分别成功比对654 bp与950 bp序列，涵盖36-37个物种。最大简约法、邻接法、最大似然法与贝叶斯推断构建的单基因树分辨率较低，而串联数据集产生更稳定的拓扑结构。Pediciidae被恢复为Tipuloidea的基部分支，Limoniidae呈并系，表明该类群当前定义未包含所有共同祖先的后代，更可能是Tipuloidea内早期分化支系的级群而非自然单系群。Chioneinae与Limoniinae被推断为单系，而Limnophilinae为非单系，尽管取样局限于芬兰的37个物种，该研究仍支持了Cylindrotomidae与Tipulidae亲缘关系密切、Limnophilinae为并系等早期假说。Petersen等结合形态与分子数据进一步探讨Tipuloidea系统发育，数据集包含45个物种，分析核基因28S rRNA、CAD（含与不含第三位密码子）及幼虫、蛹、成虫阶段的100个形态特征，采用最大简约法与贝叶斯推断建树，分别对单基因分区、单独形态数据及组合数据集开展分析，贝叶斯推断仅应用于组合数据集。单分区分析产生冲突拓扑，组合数据集则得到更稳健一致的树。结果强支持Tipuloidea的单系性，Pediciidae为其最基部分支，是所有其他大蚊类的姐妹群；同时恢复Tipulidae与Cylindrotomidae组成的强支持支系，Limoniidae再次被恢复为并系。并非所有分支都得到良好解析，例如Atarba Osten Sacken, 1869属无法被明确归入任何支系。基于此，Petersen等提出修订的大蚊两科分类系统：Pediciidae与Tipulidae，原Limoniidae至少拆分为八个亚科并入Tipulidae，同时包含Cylindrotominae与Tipulinae。但作者也承认，其取样不足现存大蚊物种的10%，需更多研究验证该分类体系。

近年中国研究团队测序了多个Limoniidae物种的完整线粒体基因组，分析了大蚊类群的亲缘关系，但物种取样仍有限。Kang等测序表征了Chionea crassipes gracilistyla Alexander, 1936的完整线粒体基因组，采用贝叶斯推断重建Tipuloidea系统发育，数据集包含4种Limoniidae、1种Pediciidae、1种Cylindrotomidae、2种Tipulidae，以2种Trichoceridae为外群，系统树恢复Pediciidae为Tipuloidea最早分化支系，支持Cylindrotomidae与Tipulidae为姐妹群，Limoniidae为非单系。Ren等先后测序表征了Limonia phragmitidis (Schrank, 1781)、Nephrotoma tenuipes (Riedel, 1910)与Pseudolimnophila brunneinota Alexander, 1913的完整线粒体基因组，均采用贝叶斯推断建树。第一项研究包含4种Limoniidae、1种Pediciidae、1种Cylindrotomidae、2种Tipulidae，以1种Trichoceridae为外群；后两项研究扩大了取样规模，分别包含4种与5种Limoniidae、1种Pediciidae、1种Cylindrotomidae、4种Tipulidae，以2种Trichoceridae与1种Anisopodidae为外群。尽管取样存在差异，所有分析均一致恢复Pediciidae为Tipuloidea的姐妹群，支持Cylindrotomidae与Tipulidae的姐妹关系，将Limoniidae置于Cylindrotomidae-Tipulidae支系的姐妹群位置，且该科始终为非单系。Kang等测序了Elephantomyiini族的两个物种Elephantomyia inulta Alexander, 1938与Helius pluto Alexander, 1932的线粒体基因组，首次完成该族线粒体基因组表征，采用贝叶斯推断与最大似然法建树，数据集包含12种Limoniidae、1种Pediciidae、1种Cylindrotomidae、13种Tipulidae，以3种Trichoceridae为外群，构建四个线粒体基因组数据集进行分析，结果同样显示Pediciidae为Tipuloidea最基部分支，重申Cylindrotomidae与Tipulidae的姐妹关系，Limoniidae为非单系。Xu等聚焦中国Dicranoptychini族，除描述2个新种、报道1个中国新记录种、提供中国Dicranoptycha Osten Sacken, 1860属物种检索表外，测序了新种Dicranoptycha shandongensis Xu, Chen & Zhang, 2023的完整线粒体基因组，采用贝叶斯推断与最大似然法重建Tipuloidea系统发育，数据集包含11种Limoniidae、1种Cylindrotomidae、3种Tipulidae，以1种Pediciidae为外群（因既往研究均支持Pediciidae为最早分化支系），结果与既往研究基本一致，恢复Limoniidae为非单系群，支持Cylindrotomidae与Tipulidae的姐妹关系。

1. 3.
   Improving the Classification of Limoniidae
   目前采用分子方法检验或优化Limoniidae分类的研究数量有限，且普遍受限于分类取样稀疏与遗传标记数量少。单基因分析常产生高度不一致的系统树，而多基因串联或分子与形态数据联合分析可获得分辨率更高、更稳定的拓扑结构，这与文献报道的序列串联可提升拓扑分辨率的结论一致。但学界已明确，依赖少量分子标记会增加系统发育推断的随机误差，源于仅取样有限的信息性状，随机相似性与同塑性会掩盖真实的演化关系，导致基于少量核苷酸或氨基酸位点的重建结果反映的是偶然相似性而非共同祖先。此外，遗传变异未必反映适应性演化，也可能源于遗传漂变、基因重复或丢失等中性进化过程，因此单基因或多基因数据集的系统发育信息有限，降低了演化关系推断的准确性与稳健性。2000年代中期以来，高通量测序技术的发展使得基因组规模分子数据集的生成成为可能，催生了系统发育基因组学领域。该领域融合演化生物学与基因组学，利用全基因组数据重建物种演化历史、研究基因家族演化、预测基因功能及推断水平基因转移等复杂演化事件，比较基因组学方法可利用全基因组信息重建物种树。基因组规模数据应用于系统发育重建初期曾备受期待，有学者认为其可解决长期存在的系统发育冲突问题，逻辑在于增加序列数据量可减少随机误差，提供足够的系统发育信号以还原生物演化历史，甚至有观点认为仅靠增加遗传标记数量即可获得稳定拓扑。但后续研究表明，增加分类取样对提升系统发育推断的效果同等甚至更为重要，前提是分类单元的选择具有策略性而非随机性。
   自引入以来，系统发育基因组学已大幅提升了学界对胎盘哺乳动物、陆生植物、昆虫等主要演化辐射类群的理解，但仍存在重要不确定性。尽管大规模性状数据集显著减少了取样不足导致的随机误差，但数据本身固有的不确定性，尤其是演化模型的选择与适用性不足，仍是重大挑战，这类偏差统称为系统误差。系统发育基因组学常见的系统误差包括组成偏好、长枝吸引、模型设定不当与异速演化。组成偏好指远缘类群因序列核苷酸或氨基酸组成相似而非真实共同祖先被错误聚类；长枝吸引指快速演化支系因趋同或同塑性替换的积累被错误推断为近缘；演化模型选择是系统发育推断的关键步骤，所有模型均简化生物现实，假设违背不可避免，若模型与“真实”演化过程偏差过大，会导致错误的树拓扑，即模型设定不当；异速演化指同一位点或基因座的演化速率随时间变化，不同谱系演化历史中经历不同的速率 regime，而许多常用模型假设跨类群的演化速率平稳同质，会干扰系统发育推断。此外，不完全谱系分选等过程导致的基因树冲突也是不一致的来源。
   鉴于Limoniidae极高的物种多样性及既往分子研究得出的冲突系统假说，系统发育基因组学方法是最有前景的解决策略。Limoniidae与其他大蚊类群虽拥有悠久的分类与形态学研究历史，但部分生物地理区域仍缺乏探索，多数物种尚无分子数据，尤其是基因组尺度数据。因此，针对性形态分析可通过识别关键分类单元指导分子取样，最大化系统发育信号。Limoniidae系统学的一大空白是对幼虫形态的认知有限，目前仅约三分之一的Limoniidae幼虫被描述，幼虫阶段的详细研究可提供关键系统发育信息，例如Pod?nien?与Gelhaus基于Phyllolabis mongolica Pod?nien? & Gelhaus, 2012的幼虫性状，将该属从Chioneinae亚科移回Limnophilinae亚科。综上，密集的分类取样对厘清Limoniidae当前分类的不确定性至关重要，全面的取样也有助于检测因谱系特异性序列组成差异等导致的系统误差。尽管Limoniidae及其他大蚊类群具有重要生态作用，但因经济重要性有限而研究不足，大规模系统发育与系统发育基因组学研究难以获得资助。考虑到该科的极高多样性与研究规模，最有效的推进方式是大蚊系统学专家团队的协同合作，可促进广泛分类取样、整合互补专业知识、生成所需基因组资源。鉴于研究复杂性，基因组浅层测序（genome skimming）可能是务实的折中方案，能以相对较低成本提供全基因组尺度数据，支撑稳健系统发育假说的构建，且该方法特别适用于博物馆标本分析，可将自然历史博物馆馆藏的大量未充分利用标本纳入系统发育基因组学研究，大幅提升分类取样规模。
2. 4.
   Concluding Remarks
   准确的生物分类是系统学的核心目标，为理解演化关系、物种识别与命名、适应模式解析提供框架，这些认知往往对制定有效保护策略至关重要。Limoniidae作为大型高多样性类群，其分类修订极具挑战性。多数形态与分子研究聚焦于两大问题：一是Limoniidae与其他大蚊科的亲缘关系，包括Tipuloidea与Trichoceridae的关系及大蚊类在双翅目中的系统位置；二是Limoniidae各亚科间的演化关系及这些亚科与其他大蚊类群的亲缘关系。目前采用分子数据解决上述问题的研究数量有限，尚未有任何研究明确厘清Limoniidae内部的系统发育关系或Tipuloidea在双翅目中的位置，但仍涌现出若干一致规律。Limoniidae与其他大蚊类群构成单系的Tipuloidea总科，正如Hennig最初提出的假说，Tipuloidea是Trichoceridae的姐妹群，二者共同组成Tipulomorpha下目。但Tipulomorpha在双翅目中的系统位置仍未解决，部分研究将其恢复为双翅目较早分化支系，另一部分则置于中间位置，未发现分子研究支持其为高度衍生类群，与Oosterbroek和Courtney的假说相悖。双翅目分类取样更广泛的研究倾向于将Tipulomorpha置于较早分化位置，而取样有限的研究多将其置于中间位。Limoniidae内部关系的研究更难解析，凸显了该科分类的高度不确定性，不同研究得出冲突的假说。Ahonen的贝叶斯分析恢复Limnophilinae为Limoniidae最早分化支系，Limoniinae为最衍生亚科，在Tipulidae与Cylindrotomidae分化之后分支；Petersen等提出的修订分类系统中，Limoniidae最早分化支系为传统归于Limoniinae的Dicranoptycha属与Stary曾置于Dactylolabinae亚科的Dactylolabis属，Limnophilinae分为两个支系，Epiphragma Osten Sacken, 1860支系较早分化，另一支系位置居中，作者指出密集取样可能进一步拆分该支系；Chioneinae也被恢复为两个独立支系，部分Limoniinae构成该科最衍生类群，传统归于Chioneinae亚科的Atarba属无法准确定位。Kang等与Ren等的线粒体基因组研究仅包含4-5种Limoniidae，Ren等的研究一致恢复Limonia与Rhipidia Meigen, 1818为姐妹群，但有限取样无法支撑科内深层关系的可靠结论。Kang等将Limoniidae取样扩大至12种，但不同数据集得出冲突结果，有趣的是Elephantomyia与Helius属形成一支，与Petersen等的结果一致，而此前线粒体研究中支持的Limonia-Rhipidia姐妹关系不再成立，表明Limoniinae内取样增加改变了推断的亲缘关系。Xu等分析多种线粒体数据集组合，同样得到不一致的拓扑，Chioneinae物种Symplecta hybrida始终被恢复为Limoniidae最早分化代表；Limnophilinae分为2-3个支系，Limoniinae分为两个支系；Dicranoptycha始终位于其余Limoniidae之外，与Petersen等的结果类似，且Dicranoptycha始终与Epiphragma形成一支，但该支系在四项分析中的三项里位置居中，与Petersen等及Kang等的结论存在差异。上述研究共同呈现出Limoniidae内部关系的高度不一致性，至少部分归因于分类取样、基因选择、数据集构成与分析方法的差异。
   尽管如此，针对Tipuloidea系统发育的研究仍显现出高阶分类层面的一致规律：Pediciidae可能为Tipuloidea最早分化支系，Tipulidae与Cylindrotomidae始终为姐妹群；而Limoniidae的单系性未被多数研究支持，表明该科为并系甚至多系群。目前唯一明确的替代分类框架由Petersen等提出，主张采用Pediciidae与Tipulidae两科系统，原Stary定义的Limoniidae将被拆分为多个更小的亚科并入Tipulidae，但该假说受限于取样不足，存在多个未解析支系。综上，Stary于1992年提出的分类系统未获分子研究支持。解析Limoniidae的系统发育可能需要整合形态数据、密集分类取样与系统发育基因组学分析的综合性方法，这依赖于分类学家的协同合作、基因组浅层测序等低成本测序策略的针对性应用，以及自然历史博物馆标本的纳入。鉴于Limoniidae及其他大蚊类群的分类学家数量有限，可行的策略是采用逐步推进的系统发育基因组学框架，随着新分类单元的加入逐步扩大取样规模并重新评估系统发育关系，上述途径共同构成了解决Limoniidae分类与演化关系的最具前景的框架。