《Advances in Biological Regulation》：DGIST: A Standardized Image-Based Spatial Quantification Workflow for Neurogenesis in the Dentate Gyrus
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摘要成年海马体在齿状回中生成新的神经元，该区域的亚颗粒区内的神经干细胞会分化为神经元和星形胶质细胞。准确量化成年神经干细胞对于评估其神经发生潜力至关重要，但目前大多数方法都依赖于对齿状回有限区域的手动密度测量。由于组织切片的形态差异，这些方法可能会引入偏差。为了解决这些问题，我们
摘要
成年海马体在齿状回中生成新的神经元，该区域的亚颗粒区内的神经干细胞会分化为神经元和星形胶质细胞。准确量化成年神经干细胞对于评估其神经发生潜力至关重要，但目前大多数方法都依赖于对齿状回有限区域的手动密度测量。由于组织切片的形态差异，这些方法可能会引入偏差。为了解决这些问题，我们开发了基于齿状回图像的空间量化工具DGIST，这是一种基于ImageJ/Fiji的工作流程，整合了BioVoxxel和MorphoLibJ插件，可对整个齿状回的细胞进行量化分析。将该工具应用于体内数据集后，DGIST能够量化由标记物定义的神经干细胞和星形胶质细胞群体随年龄的变化情况。我们的研究结果表明，DGIST为量化成年神经发生区域中由标记物定义的细胞群体提供了一种可重复的方法。
引言
成年动物的神经发生主要发生在哺乳动物大脑的两个区域：海马齿状回的亚颗粒区和侧脑室旁的室下区（Suh等人，2007年；Brazel等人，2005年）。齿状回中的新颗粒细胞会融入海马回路，从而帮助记忆形成和模式区分（Toni等人，2008年；Yassa与Stark，2011年；Schneider等人，2022年）。在成年小鼠中，亚颗粒区的神经干细胞会生成神经元和星形胶质细胞（Suh等人，2007年；Schneider等人，2022年）。新生成的颗粒神经元会向颗粒细胞层移动一段距离，并将其苔藓纤维轴突延伸到CA3区域。随着年龄的增长，齿状回的神经发生能力会下降，这主要是由于神经干细胞数量减少以及处于静息状态的时间增加所致（Martín-Suárez等人，2019年；Cole等人，2022年）。
准确测量成年齿状回中特定细胞群体的数量对于评估不同年龄阶段的神经发生情况十分重要。由于细胞身份取决于独特的标记物组合（Zhang与Jiao，2015年；Sun等人，2017年），因此量化策略应与分析目的、标记物定义、感兴趣区域以及计数方法相契合。在这些因素中，感兴趣区域的选择和计数方法对成像分析的结果差异影响最大。
目前用于选择齿状回感兴趣区域的方法往往依赖于对有限区域内的密度测量。由于齿状回的形态沿头尾轴存在差异，且神经干细胞分布在亚颗粒区、颗粒细胞层以及齿状回丘等多种位置，因此需要一种更为全面的方法（Amaral等人，2007年）。对于大型数据集或多个实验组而言，手动计数显然是不现实的（Guirado等人，2018年；Woeffler-Maucler等人，2014年）。尽管体视学方法较为严谨，但由于需要對多个切片进行采样，因此会增加工作量（Zhao与van Praag，2020年；Golub等人，2015年）。这些挑战凸显出有必要采用一种可重复的、基于细胞的工作流程，以便高效地对整个齿状回进行量化分析，从而系统地研究成年动物的神经发生情况（Zhao与van Praag，2020年；Terreros-Roncal等人，2023年）。
为了解决这些存在的问题，我们开发了基于齿状回图像的空间量化工具DGIST，这是一种基于ImageJ/Fiji的可重复工作流程，整合了BioVoxxel和MorphoLibJ插件。DGIST能够在密度极高的齿状回组织以及多个切片或不同年龄组中实现一致的细胞级别量化分析。我们利用DGIST分析了Nestin-CreERT2/p18-P2A-mKO2小鼠齿状回中由标记物定义的细胞群体，并量化了其随年龄的变化情况。
虽然先前的研究已经表明，与干细胞相关的细胞群体数量会随年龄增长而减少（Lugert等人，2010年；Encinas等人，2011年；Bonaguidi等人，2011年；Ryu等人，2021年），但DGIST为成年海马神经发生过程中基于细胞的精准量化分析提供了一种实用的工作流程。与传统方法相比，DGIST能够实现对整个齿状回的分区域量化分析，同时还能降低主观误差，从而有助于开展更系统、更客观的研究。
章节节选
齿状回分区域定义及基于DAPI的核段分离分析流程概述
我们开发了一种基于DAPI的分析流程DGIST，用于对齿状回的不同分区域进行针对性定量分析（图1A）。DGIST整合了分区域定义、基于DAPI的核段分离以及标记物量化分析功能，所有分析都在特定的解剖学感兴趣区域内进行。在Fiji软件中，我们利用DAPI标记出的边界为所有切片图像定义了齿状回的不同分区域（丘、亚颗粒区和颗粒细胞层）（图1B）。这些边界只需为每个切片设置一次，之后即可应用于所有的标记物通道和核掩模上。由于齿状回内细胞密度极高，
讨论
准确解读生物成像数据对于避免得出错误结论至关重要。在定量组织研究中，生物学的变异因素以及图像处理方法都会对分析结果产生影响。与实验室传统实验类似，图像分析也需要在多个阶段做出决策，包括数据预处理、信号检测、对象定义以及统计分析等。近年来，有一些举措旨在规范图像采集和分析的相关报告标准（Schmied等人，2024年），
实验动物
本研究采用了C57BL/6品系背景下的Nestin-CreERT2; p18-P2A-mKO2双杂合小鼠（Lee等人，2025年）作为实验对象，通过成像技术进行量化分析。这些小鼠被置于12小时光照/黑暗周期的环境中（光照时间为08:00–20:00），可随时获取食物和水。研究涵盖了雌雄两种性别的小鼠，但由于样本量有限，没有对性别因素进行单独分析。所有实验操作均获得了韩国驻外机构动物护理和使用委员会的批准（IACUC-26-00002）。本研究共分析了四个年龄组的小鼠：P15、2
关于手稿准备过程中所使用的生成式AI及AI辅助技术的声明
在手稿准备过程中，我们使用了ChatGPT（OpenAI，版本5.5）和Grammarly（Superhuman Platform，版本8.938.0）来优化语言表达并提升文本的清晰度。所有由AI辅助生成的内容都经过了作者们的审核和修改，作者们仍对研究的科学内容及结论承担全部责任。本研究没有使用任何生成式AI工具来创建或修改图表、图像或其他图形资料。
CRediT作者贡献说明
Yoichi Kosodo：概念设计、写作——审阅与编辑、项目指导。Jinhee Lee：概念设计、正式分析、方法学、软件应用、结果验证、数据可视化、写作——初稿撰写。Wonyoung Lee：资源协调、项目指导
数据可用性
本研究的相关数据，如需获取，可向通讯作者提出合理请求后获得。
利益冲突声明
? 作者们声明自己不存在任何已知的、可能影响本研究结果的财务利益关联或个人关系。
致谢
我们要感谢实验室的各位成员，尤其是MK Shin，他在整个研究过程中为我们提供了许多宝贵的建议；同时也要感谢JW Jung在图像处理方面给予的指导。此外，MI Baek和YS Oh也为本研究提供了诸多有益的建议。
本研究得到了韩国脑研究研究所的基础研究计划支持，该计划由韩国科学和信息通信技术部资助（项目编号为26-BR-01-03和26-BR-05-04，资助对象为Y.K.）；同时还获得了韩国国家研究基金会的资助，该基金也由韩国科学和信息通信技术部提供支持（项目编号为RS-2022-NR068996）。
Jinhee Lee|Wonyoung Lee|Yoichi Kosodo
韩国脑研究研究所神经回路研究组，神经再生实验室，大邱，韩国
