尿石素B通过调节SLP2/PINK1/Parkin信号通路改善抑郁大鼠的抑郁样行为和海马神经元损伤

《Brain Research Bulletin》：Urolithin B Ameliorates Depressive-like Behavior and Hippocampal Neuronal Damage in Depressed Rats via regulation of the SLP2/PINK1/Parkin Signaling Pathway

　　

尿石素B（Urolithin B, UB）通过调节SLP2/PINK1/Parkin信号通路改善抑郁大鼠的抑郁样行为和海马神经元损伤。UB减轻慢性不可预测温和应激（Chronic Unpredictable Mild Stress, CUMS）诱导的抑郁样行为和大鼠海马损伤。UB的抗抑郁作用可能与上调海马神经元中SLP2表达有关。SLP2调节PINK1/Parkin通路，促进线粒体自噬（mitophagy），维持神经元能量稳态。体内敲低SLP2逆转UB的抗抑郁和神经保护作用。

抑郁症是一种高发病率、高致残率的精神障碍，其临床表现包括持续情绪低落、兴趣减退、认知功能损伤及生理功能紊乱。当前临床治疗主要依赖单胺能抗抑郁药，如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors, SSRIs），但这些药物普遍存在起效延迟、疗效有限（约三分之二患者应答）、副作用多及停药后复发率高的问题。因此，探索抑郁症发病机制并寻找新的治疗靶点至关重要。抑郁症的发病机制复杂，涉及神经递质失衡、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱、慢性神经炎症以及神经可塑性受损。海马作为对压力高度敏感的关键脑区，呈现神经元萎缩、神经发生减少和突触丢失，这些是抑郁症的病理标志。神经炎症和氧化应激被确认为关键病理因素，而细胞能量代谢失调，尤其是线粒体功能障碍，在抑郁症发病中发挥核心作用。慢性应激可破坏线粒体功能，引发氧化应激、能量代谢危机，最终导致神经元损伤和突触可塑性下降。因此，靶向线粒体功能以恢复神经元稳态已成为抗抑郁治疗的新方向。尿石素B（Urolithin B, UB）是膳食鞣花单宁经肠道菌群代谢产生的主要生物活性代谢物，广泛存在于石榴、核桃和浆果中。既往研究表明，UB及其类似物具有抗炎、抗氧化和调节细胞能量代谢的药理活性。然而，UB对抑郁症是否具有治疗作用，尤其是能否保护抑郁症核心病理脑区海马，尚不清楚。研究人员通过建立慢性不可预测温和应激（Chronic Unpredictable Mild Stress, CUMS）诱导的大鼠抑郁模型，并给予UB干预，整合行为学、组织病理学、单细胞转录组学及分子生物学技术，系统评估UB对模型大鼠抑郁样行为及海马损伤的改善作用，旨在识别其关键分子靶点和下游信号通路，从而为抑郁症治疗提供新的理论基础和天然化合物干预策略。该研究论文发表在《Brain Research Bulletin》。

研究人员为开展研究主要运用了以下关键技术方法：①建立CUMS大鼠抑郁模型，样本来源为雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6周龄，180–200 g，SPF级，购自Dashuo Biological Co., Ltd），并实施UB腹腔注射干预；②行为学测试包括糖水偏好实验（Sucrose Preference Test, SPT）、旷场实验（Open Field Test, OFT）、悬尾实验（Tail Suspension Test, TST）和强迫游泳实验（Forced Swim Test, FST）；③组织病理学分析采用苏木精-伊红（H&E）染色、尼氏（Nissl）染色和免疫荧光染色；④酶联免疫吸附实验（ELISA）检测脑组织脑源性神经营养因子（BDNF）、5-羟色胺（5-HT）、皮质酮（CORT）及促炎细胞因子；⑤单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据来自GEO数据库（GSE297773，含成年雄性Wistar大鼠海马组织），借助Seurat包进行细胞聚类和差异表达基因分析；⑥原代大鼠海马神经元（Hippocampal Neurons, HNs）分离培养及慢病毒介导的SLP2敲低/过表达，结合ATP含量检测、透射电镜（TEM）观察线粒体超微结构和自噬体，以及Western blot检测自噬和线粒体自噬相关蛋白。

研究结果如下：

**3.1 Urolithin B Ameliorates Depressive-like Behavior and Hippocampal Damage in CUMS Rats**
通过CUMS模型大鼠行为学测试发现，与正常对照组（NC）相比，模型组（MOD）大鼠体重下降、糖水偏好率显著降低，悬尾实验和强迫游泳实验不动时间显著延长，旷场实验总路程和平均速度显著减少，表明抑郁样行为成功诱导。不同剂量UB（10、20、40 mg/kg）干预后，上述行为学参数均有不同程度改善，其中中剂量（20 mg/kg）组效果最显著。组织病理学染色显示，MOD组海马神经元（HNs）数量减少、排列紊乱、核固缩深染，而UB处理组HNs数量增加、固缩细胞减少，同样以中剂量组改善最明显。免疫荧光染色显示MOD组神经元标志物NeuN和突触蛋白SYN1荧光强度显著下降，UB处理部分恢复其表达。ELISA检测发现MOD组脑组织BDNF和5-HT水平显著降低，而CORT水平显著升高，不同剂量UB逆转这些变化，中剂量效果最强。此外，UB显著抑制CUMS诱导的促炎细胞因子IL-6和IL-1β分泌，并上调抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值、下调caspase-3表达。结果表明UB干预有效改善CUMS大鼠抑郁样行为，减轻海马神经元损伤、神经炎症和凋亡。

**3.2 scRNA-seq Analysis Reveals Potential Molecular Mechanisms of Urolithin B against Rat Depression**
基于GEO数据库中大鼠脑组织scRNA-seq数据集（GSE297773），通过无监督聚类识别出26个细胞簇，并依据特征标记基因定义7种主要细胞类型（星形胶质细胞、终纹床核相关细胞、中间神经元、小胶质细胞、HNs、少突胶质细胞和少突胶质前体细胞）。比较发现MOD组HNs比例显著低于NC组，而UA处理组（MOD+UA）HNs比例上调，提示HNs比例变化可能与抑郁症病理过程相关。针对HNs的差异表达基因分析显示，SLP2在MOD+UA组显著上调。GO富集分析显示HNs差异基因富集于多种自噬通路，包括糖自噬、异源自噬、核自噬和线粒体自噬。qRT-PCR和Western blot验证显示，与NC组相比，MOD组大鼠海马组织SLP2 mRNA和蛋白水平显著降低，UB处理后SLP2表达上调，中剂量组升高最显著。据此提出科学假说：UB可能通过上调CUMS大鼠SLP2表达，促进HNs线粒体自噬过程，从而改善海马损伤和抑郁样行为。

**3.3 SLP2 Promotes Mitophagy in Rat HNs**
从新生SD大鼠海马分离原代HNs，经免疫荧光鉴定NeuN阳性细胞比例约90%。构建SLP2敲低（sh-SLP2）和过表达（oe-SLP2）质粒并验证转染效率。ATP检测显示，SLP2敲低导致细胞内ATP含量显著下降，而SLP2过表达有效恢复ATP水平。透射电镜观察显示，sh-SLP2组自噬体数量减少、线粒体明显损伤（肿胀、嵴中断、基质空泡化）；oe-SLP2组自噬体数量增加、受损线粒体减少、正常形态线粒体比例升高。Western blot检测自噬相关蛋白表明，SLP2敲低抑制LC3-II/LC3-I比值并上调p62表达，而SLP2过表达升高LC3-II/LC3-I比值并下调p62表达。进一步检测线粒体生物发生关键因子PGC-1α和TFAM以及经典线粒体自噬起始标志物PINK1和Parkin蛋白表达，结果显示SLP2敲低显著抑制这些蛋白表达，而SLP2过表达有效促进其表达。结论：SLP2通过调节PINK1/Parkin通路正向调控HNs线粒体自噬，并促进线粒体生物发生。

**3.4 In Vivo Knockdown of SLP2 Reverses the Antidepressant and Neuroprotective Effects of Urolithin B**
在CUMS大鼠海马进行靶向SLP2敲低，qRT-PCR确认敲低成功。行为学测试显示，MOD组大鼠出现抑郁样行为，UB治疗有效逆转这些行为缺陷，而SLP2敲低显著减弱UB对抑郁样行为的改善作用。组织病理学分析显示，UB治疗减轻CUMS诱导的HNs数量减少、排列紊乱和核固缩，而SLP2敲低部分阻断UB的神经保护作用，海马组织再次出现明显神经元损伤征象。免疫荧光染色显示SLP2敲低组NeuN和SYN1荧光强度显著低于MOD+UB+sh-NC组，提示神经元存活和突触完整性受损。ELISA检测发现SLP2敲低组脑组织BDNF和5-HT大幅降低，CORT及促炎细胞因子IL-6、IL-1β大幅升高，表明SLP2敲低削弱了UB对神经保护和神经炎症的调节作用。免疫荧光染色显示SLP2敲低组脑组织PINK1荧光强度显著弱于MOD+UB+sh-NC组。结论：体内敲低SLP2有效逆转UB对CUMS大鼠抑郁样行为、海马结构损伤及相关分子紊乱的改善作用，该机制与PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路密切相关。

讨论部分指出，本研究通过行为学、海马组织病理学、单细胞转录组学及神经元功能实验，揭示天然化合物UB通过上调HNs中SLP2表达，调节PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路，改善CUMS诱导的抑郁样行为和海马神经元损伤。该发现为抑郁症治疗提供了潜在天然化合物干预策略和以SLP2为核心的新靶点。研究局限性包括：仅使用雄性大鼠模型，未考虑性别差异；每组样本量相对较小；scRNA-seq数据来自公共数据库，基于UA处理的抑郁模型，未来需对MOD+UB组大鼠脑组织进行scRNA-seq；UB上调SLP2表达的具体分子机制未阐明；体内救援实验未设单独SLP2敲低组；主要聚焦于HNs，其他脑区的影响有待研究。结论部分翻译如下：综上所述，本研究发现天然化合物UB通过上调SLP2、调节下游PINK1/Parkin信号并增强线粒体自噬，发挥抗抑郁和海马神经保护作用，为抑郁症治疗提供了新的候选药物和以SLP2为中心的干预靶点。