进餐时间引带脑干饱食中枢迷走神经背核复合体的昼夜节律

《PLOS Biology》：Meal timing entrains circadian rhythms in the dorsal vagal complex, a brainstem satiety centre

　　

迷走神经背核复合体（DVC）包括一个多组分的脑干饱食中枢，该中枢作为抗肥胖药物治疗的关键靶点而备受关注。研究人员近期的研究揭示了其昼夜节律计时特性，其分子和电生理的24小时节律独立于原发性下丘脑时钟而持续存在。然而，引带这些脑干振荡器的因素以及DVC分子时钟的下游转录靶标仍不清楚。在此，利用PERIOD2::LUCIFERASE（PER2::LUC）报告小鼠和荧光原位杂交，研究人员定量证明了离体和活体条件下尾侧DVC中核心时钟基因表达的节律。研究表明，在活体条件下，分子时钟与DVC中多种神经递质受体基因的节律性表达相关，且时钟和时钟控制基因表达的相位均受进餐时间的严格调控。这些发现揭示了DVC中由食物引带的昼夜节律，并对靶向脑干饱食机制的临床研究具有重要启示。

在哺乳动物中，调节进食的神经回路能微调以适应营养物质组成和环境中食物的日常模式。下丘脑视交叉上核（SCN，哺乳动物的中枢昼夜节律时钟）主要受环境光照引带，而在时间限制性进食（TRF）条件下，食物成为了一个额外的竞争性时间线索。进食预期活动（FAA，在重复定时进食前发生的行为觉醒）在很大程度上独立于SCN，被认为是由脑部和外周器官中SCN外振荡器组成的食物可引带振荡器（FEO）网络驱动的。尽管进行了广泛研究，但FEO的解剖位置尚未完全定位。研究表明，后脑中的迷走神经背核复合体（DVC，代谢控制领域的脑干饱食中枢）表现出强健的昼夜计时特性，且因其在抗肥胖药物作用中的关键角色而备受关注。DVC由最后区（AP，血源性线索感受器）、孤束核（NTS，迷走神经传入的主要接收器）和迷走神经背核（DMV，外周输出）这三个解剖和功能不同的结构组成。然而，目前尚不清楚食物摄入是否及如何作为引带DVC昼夜振荡器的时间线索，以及这种分子时钟的功能输出如何调节其他基因的转录。因此，本研究旨在评估尾侧DVC在AP水平的昼夜节律特性是否对进食时间敏感，探究改变进食时间表对DVC内基因表达的后果，并调查该脑干中心时钟基因的表达对进餐结构和模式的贡献。研究人员通过在存在竞争性时间线索的条件下进行实验，发现DVC的昼夜节律响应进食时间而非光暗（LD）周期，且其分子时钟影响进餐时长但不影响FAA的表达。这些内容发表于《PLOS Biology》。此项研究揭示了食物引带的节律能塑造下游时钟控制基因的节律性转录，从而将DVC基因表达与进食行为对齐，对优化靶向脑干回路的时辰药理学策略具有潜在临床意义。

在研究方法方面，研究人员主要使用了由布里斯托大学动物服务部繁育的成年C57BL/6J背景小鼠（含PER2::LUC报告小鼠和Bmal1^lox小鼠队列）。关键技术方法包括：利用PER2::LUC报告系统进行离体组织生物发光成像记录；采用RNAscope荧光原位杂交技术对脑切片中的基因表达进行高分辨率空间定量分析；运用RT² Profiler PCR阵列和NanoString nCounter技术进行转录组学测序以评估神经递质受体基因的节律性表达；通过立体定向注射腺相关病毒（AAV）诱导DVC神经元中Bmal1基因敲除以评估行为表型；并利用TSE PhenoMaster系统长期监测小鼠的进食、饮水和跑轮行为节律。

在研究结果方面：
**尾侧DVC的昼夜计时**
通过离体培养PER2::LUC报告小鼠的脑干切片，研究人员观察到PER2::LUC节律性表达贯穿整个吻-尾向的AP及其下方的NTS区域，并在第四脑室的室管膜层中也检测到了非神经元的生物发光节律。结合RNAscope技术，研究人员在活体条件下证实了处于AP水平的尾侧DVC（包含AP、NTS、DMV和4thV_ep四个亚结构）在离体和活体下均具有强健的分子昼夜节律计时特性，且在活体状态下，各振荡器的节律相位同步。

**DVC转录程序的日节律**
为了探索分子时钟的下游输出，研究人员通过PCR阵列检测了AP和NTS中神经递质受体基因的表达。结果表明，在自由进食条件下，有大量神经递质受体转录本在AP和NTS中表现出昼夜节律性，且峰值时相主要集中在夜间中段。模体分析显示大多数节律性转录本含有BMAL1结合位点的E-box。短暂的禁食/重喂食对整体神经递质基因表达模式影响微弱，表明这些下游基因的节律性主要由核心时钟基因表达主导，而非急性进食行为。

**TRF期间DVC中的核心时钟基因表达**
在长达6至7天的TRF干预下，小鼠产生了显著的进食和饮水节律。通过RNAscope检测，研究人员发现无论食物在白天还是夜间提供，所有DVC亚结构中的核心时钟基因（Bmal1、Per2、Reverbα）均表现出节律性表达，其表达峰值精确地与进餐时间对齐，而非光暗周期。受体机制方面，尾侧TRF（相位提前）能引人地DVC节律相位，而遵守早期日间或深夜TRF则会导致大部分振荡器发生不同程度的相位错位，尤其是NTS最能灵活响应进食时间的改变。

**TRF引带DVC转录程序的节律**
研究人员利用NanoString nCounter技术探索了TRF对下游神经递质受体基因转录节律的相位影响。结果显示，在TRF条件下，所选的神经递质受体基因转录节律随之发生了相应的相位偏转，以与进食时间同步。这证实了由食物引带的分子钟节律能够驱动下游基因的转录节律，确保神经递质受体表达与进食行为同步。

**DVC神经元中的分子钟决定进餐时长但对进食预期活动并非必需**
通过向Bmal1^lox小鼠的AP和NTS中注射AAV-Syn-Cre病毒构建特异性敲除小鼠，研究人员对小鼠进行了行为表型测试。结果显示，DVC特异性Bmal1敲除虽轻微降低了光暗循环下的夜间跑轮活动，但并不影响总摄食量和进食节律。值得注意的是，小鼠在光照阶段的平均进餐持续时间显著延长，表明DVC完整的分子时钟参与调控进食量与随后的进餐终止机制。在夜间限制喂食测试中，进食预期活动（FAA）在敲除小鼠中完全不受影响。这表明神经元中的Bmal1时钟基因表达对于FAA的产生并非必需，而是调控影响进食终止机制的必要因素。

在讨论与结论部分，研究人员总结了该研究的关键发现：DVC在活体中表现出受进食时间强烈影响的日节律特性，证实了进食计划是引带包括DVC在内的SCN外振荡器的有效时间线索。在光照与食物竞争的条件下，DVC的时钟基因表达主要受TRF引带并凌驾于光暗周期之上。最为核心的结论是，这种食物引带效应影响了神经递质受体基因的及时转录，从而使DVC的转录组与进食行为保持同步。研究还发现该进食引带作用在24小时周期内呈现出一定的灵活性差异，晚期TRF比凌晨TRF更容易重置DVC节律。结合基因敲除实验，确定DVC作为FEO网络中的关键节点具有双重角色：既能够作为一个灵活的响应节点调整其转录程序以预测进食计划，同时也参与决定个体进餐的时间架构。研究人员最后提出，将进餐时间纳入时辰药理学策略中靶向DVC回路，有望提高抗肥胖和糖尿病药物的临床疗效。