基于实验与计算方法研究卢卡脂肪酶在甲醇中的稳定性，以利用废弃食用油生产生物柴油

《International Journal of Biological Macromolecules》：Experimental and computational analysis of LUCA lipase stability in methanol for biodiesel production from waste cooking oil

　　摘要：利用脂肪酶进行酶法生物柴油生产为化学催化提供了一种可持续的替代方案；然而，热不稳定性和甲醇导致的酶失活等问题可能限制其工业应用。本研究探讨了从1.3家族脂肪酶中重构得到的原始LUCA脂肪酶的催化效率与结构稳定性，该酶被固定在Seplite LX120载体上，用于高效利用废弃烹饪油生产生物柴油。实验结果表明，固定化处理显著提升了该酶的热稳定性，在70℃条件下其半衰期可达61.45小时，约为游离LUCA脂肪酶（15.04小时）的4倍。在60℃至80℃、25%（体积比）甲醇环境中暴露180分钟后，固定化的LUCA脂肪酶仍保持58.23%–77.57%的活性，而游离LUCA脂肪酶的活性则明显下降。分子动力学模拟显示，无论在水中还是甲醇中，LUCA脂肪酶的催化三联体结构都具有极高的刚性，在70℃时会出现独特的甲醇特异性“热稳定平台”。这种结构稳定性使得固定化的LUCA脂肪酶能够快速高效地生产生物柴油，在70℃条件下，其最大生物柴油产率可在2小时内获得，而游离脂肪酶则需要3小时。该固定化生物催化剂连续9次循环后仍能保持100%的生物柴油产率，第10次循环时仅略有下降至99.13%。此外，该工艺在1千克搅拌罐反应器中成功实现了100倍的放大，证明了固定化原始LUCA脂肪酶的工业应用潜力。这些研究结果为利用原始酶实现可持续的工业化生物能源生产提供了有力的技术支撑。

引言：随着对可持续可再生能源需求的增加，以及人们对化石燃料使用带来的环境问题的关注，生物柴油作为石油基柴油的替代品受到了越来越多的研究重视[1]、[2]。生物柴油主要由脂肪酸甲酯组成，通常通过甘油三酯与短链醇（最常见的是甲醇）的酯交换反应来制备[3]。在各种原料中，废弃烹饪油因其成本低、来源广泛且具有环境效益而备受关注。使用废弃烹饪油不仅可以降低生产成本，还能减少不当处理带来的环境污染，有助于推动循环型生物经济战略的发展[4]。传统的生物柴油生产多采用均相碱性催化剂，因为它们具有较高的转化效率。然而，这类催化剂对游离脂肪酸极为敏感，容易形成皂类物质，导致产物分离复杂并产生废水，这些问题在处理废弃烹饪油时尤为突出[5]。而利用脂肪酶进行酶法酯交换则是一种很有前景的替代方法，因为它操作条件温和、选择性高，且能耐受富含游离脂肪酸的原料[6]、[7]。尽管有这些优势，但酶法生物柴油生产仍受到脂肪酶在含甲醇环境中的不稳定性的限制[8]。甲醇会破坏酶的三级结构，改变氢键并去除重要的水合层，从而导致酶的构象变化和活性丧失[9]。要克服这一难题，就需要开发出在工业条件下仍能保持结构稳定的强韧且耐热的生物催化剂。

固定化技术已被广泛用于提高酶的刚性、便于催化剂回收以及提升其重复使用性能。商业化的脂肪酶，如南极假丝酵母脂肪酶B、毛状热霉菌脂肪酶和米黑根霉脂肪酶，在固定在不同载体材料上后，均表现出良好的生物柴油生产催化性能[10]、[11]、[12]、[13]。在各类载体中，Seplite LX120作为一种含有胺功能团的高交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物，被证明是酶固定的理想载体。它的微孔结构、较小的孔径以及较大的表面积为酶的附着提供了大量位点。先前的研究已成功将一些酶，如来自菲分枝杆菌的羧酸还原酶以及来自地热无氧芽孢杆菌的超高耐热性羧酸酯酶EstD9固定在Seplite LX120上，从而提升了这些酶的热稳定性、溶剂耐受性、储存稳定性以及重复使用性能[14]、[15]。最近，一种来自南极假单胞菌的耐寒脂肪酶也被固定在Seplite LX120上，并成功应用于废弃烹饪油的生物柴油生产，展现了出色的催化性能[16]。迄今为止，针对工业应用的酶固定化研究大多集中在现有的脂肪酶上，而重构的原始脂肪酶则尚未得到充分研究[17]。近期研究表明，与现代衍生物相比，重构的原始酶往往具有更优异的物理化学性质，包括更高的热稳定性、更宽的pH耐受范围、更强的催化活性以及更高的底物或催化通用性[18]、[19]、[20]、[21]。这些特性使得重构的原始酶成为在恶劣操作条件下用于工业生物催化的理想候选者。

本研究中所分析的原始LUCA脂肪酶是通过对细菌I.3家族脂肪水解酶的原始序列进行重构得到的。此前已有研究证明，这种脂肪酶具有出色的热稳定性和溶剂耐受性，其最佳催化温度为70℃，这一数值高于许多现代I.3家族脂肪酶的报道值[22]。这些特性表明该酶已进化适应了高温环境，因此在恶劣操作条件下具有很大的工业生物催化应用潜力。我们之前已经证明，重构的LUCA脂肪酶可以成功固定在Seplite LX120上，从而可用于废弃烹饪油的生物柴油生产。固定化的LUCA脂肪酶表现出优异的短期热稳定性，在30分钟的培养过程中，其在20–100℃范围内的活性仍可保持在80%以上；在经过10次重复使用后，其活性仍可保持95.35%；在4℃下储存12周后，其残余活性仍可超过50%。重要的是，该生物催化剂在3小时的酯交换反应后仍能实现100%的生物柴油产率。此外，我们的初步评估表明，当在70℃下将固定化的LUCA脂肪酶暴露于25%（体积比）甲醇中30分钟时，其活性仍可保持约127%[17]。虽然这些短期研究结果十分令人鼓舞，但它们并未反映完整工业操作过程中的持续应力情况，也正是这一局限性促使我们开展了本研究中关于长期热稳定性和甲醇稳定性的深入评估。尽管取得了这些积极成果，但目前仍缺乏针对游离和固定化LUCA脂肪酶在废弃烹饪油酯交换反应中的系统优化研究，而且其在含甲醇环境中的催化稳健性与稳定性的分子机制也尚未被充分阐明。计算方法，尤其是分子动力学模拟，为揭示蛋白质在工业相关条件下的结构行为提供了有力工具。将分子模拟与实验研究相结合，有助于从机理层面了解酶在复杂反应环境中的稳定性与催化行为[23]。

以往关于重构的原始LUCA脂肪酶的研究主要集中在其游离状态和固定化状态下的物理化学特性，以及其在废弃烹饪油生物柴油生产中的初步应用。同样，其他耐热脂肪酶的研究也多侧重于催化性能和生物柴油产率，而较少有研究将酶的稳定性评估、分子级结构分析、工艺优化以及反应器规模验证整合到同一项研究中[24]、[25]、[26]。因此，关于重构的原始脂肪酶在工业相关反应环境中具有异常高稳定性的分子机制至今仍未得到充分研究[17]、[22]、[27]。填补这一知识空白对于合理开发用于可持续生物柴油生产的强韧生物催化剂至关重要。为此，本研究结合了对热稳定性和甲醇稳定性的深入评估、废弃烹饪油酯交换反应的系统优化、分子动力学模拟以及反应器规模验证，旨在明确该酶的催化性能及其稳定性的分子机制。具体而言，本研究：（i）评估了游离和固定化LUCA脂肪酶的长期稳定性、热失活规律及半衰期动力学，以及其在甲醇中长时间培养时的稳定性；（ii）构建并验证了LUCA脂肪酶的结构模型，随后通过分子动力学模拟揭示其在水和含甲醇环境中的构象变化规律；（iii）优化了酯交换反应的关键参数，包括甲醇与油的摩尔比、反应温度、催化剂用量以及反应时间，以最大化生物柴油的产率；（iv）评估了催化剂的再生与重复使用性能；（v）证明了游离和固定化LUCA脂肪酶在搅拌罐反应器中用于生物柴油生产的可行性。总体而言，这项综合研究不仅证明了重构的原始LUCA脂肪酶在游离状态和固定化状态下均具有用于生物柴油生产的实际应用价值，还从分子层面揭示了其在工业相关条件下的稳定性特征。