《Food Reviews International》：Serum-Free Media Development Strategies for Cultivated Meat: A Machine Learning-Assisted Systematic Scoping Review
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全球人口增长和与传统肉类生产相关的环境问题要求可持续替代方案。培养肉具有巨大潜力，但其可扩展性仍受限于对胎牛血清（FBS）的依赖，这引发了关键的伦理、经济和环境问题。这项遵循PRISMA-ScR指南，在Scopus、Web of Science和PubMed（
全球人口增长和与传统肉类生产相关的环境问题要求可持续替代方案。培养肉具有巨大潜力，但其可扩展性仍受限于对胎牛血清（FBS）的依赖，这引发了关键的伦理、经济和环境问题。这项遵循PRISMA-ScR指南，在Scopus、Web of Science和PubMed（2000年至2025年9月）中进行的系统性范围综述，综合了细胞农业中无血清培养基开发的可持续策略。研究人员确定了两种主要方法：循环细胞培养（CCC）系统和农业食品侧流价值化。CCC系统将微藻或蓝细菌与哺乳动物成肌细胞整合，实现培养基回收。生长速率与FBS补充的对照组相当，氨减少98%，乳酸减少68%。然而，逐渐的营养消耗和系统复杂性限制了当前的应用。侧流价值化表明，来自农业副产品的蛋白质分离物可以支持成肌细胞增殖。油菜籽蛋白分离物表现优于重组白蛋白15%，酶法提取将蛋白质产量比传统方法提高高达930%。剩余的挑战包括相对于10% FBS的次优增殖、过早分化、持续的营养消耗以及生命周期评估的关键缺乏。整合标准化的提取方案与优化的培养条件对于释放商业规模的培养肉生产至关重要。
Introduction：全球人口增长和传统肉类生产的环境影响推动了可持续替代方案的需求。培养肉潜力巨大，但依赖胎牛血清（FBS）带来了伦理、经济和环境挑战。细胞农业利用组织工程方法生产肉类，但需优化培养基成分。本研究旨在通过系统性范围综述，总结无血清培养基开发的可持续策略，特别是循环细胞培养（CCC）系统和农业食品侧流价值化，并强调机器学习辅助分类方法的应用。
Cultivated meat: the FBS challenge：FBS是细胞培养中广泛使用的生长补充剂，含有生长因子（如FGF2、EGF、IGF1、NRG1、TGFβ1、PDGFB）、激素、白蛋白、转铁蛋白等。白蛋白是最丰富的蛋白质，对细胞粘附、生长和分化至关重要。FBS存在批次差异、成本高（培养基占生产成本超99%）、伦理问题（动物福利）等。重组白蛋白虽可替代，但成本高，不适合大规模生产，因此需寻找廉价有效的替代品，如植物蛋白水解物和微藻提取物。
Methods：遵循PRISMA-ScR指南，检索Scopus、Web of Science和PubMed数据库（2000年至2025年9月）。纳入标准为同行评审原创研究，涉及培养肉/鱼的无血清或减血清培养基，且测试了至少一种FBS生物分子的替代，使用动物细胞类型（如成肌细胞、卫星细胞等）。排除综述、非英文、植物基替代品、人类细胞相关等。通过机器学习和手动筛选，最终纳入98篇论文。使用BERTopic进行主题建模，结合SciBERT嵌入和HDBSCAN聚类，生成10个主题，然后映射到7个研究类别（如植物基和循环方法、微生物和重组蛋白等）。通过规则细化分类，最终聚焦于植物基和循环方法类别。
Results：K-means和层次聚类将332篇候选论文分为两个主题簇：簇1（113篇，34.1%）包含细胞生物学和生物过程工程术语，如“血清”、“细胞”、“牛”、“培养基”、“卫星细胞”、“增殖”等，代表技术研究；簇2（219篇，65.9%）涉及社会技术词汇，如“食品”、“农业”、“可持续”、“消费者”等，代表社会经济和政策研究。数据集显示，研究从2019年开始增长，2023年达到峰值（42篇）。细胞系开发占主导（43.9%，n=43），植物基和循环方法占19.4%（n=19），其次是动物基成分（13.3%）、微生物和重组蛋白（9.2%）、生物过程优化（7.1%）、计算建模（3.1%）、生命周期评估（2.0%）和其他（2.0%）。GAP分析显示，细胞系开发过度代表（3.51倍预期），而生命周期评估（0.16倍）和计算建模（0.24倍）严重不足。
Discussion：
CCC SYSTEMS：循环细胞培养（CCC）系统通过微藻或蓝细菌与哺乳动物成肌细胞共培养，实现培养基回收和废物清除。
First generation cell culture systems：Haraguchi等首次提出CCC系统，利用C2C12成肌细胞与Chlorococcum littorale交替培养，氨清除率达91.8%，细胞增殖（4.5±1.5倍）接近含血清DMEM（5.0±1.2倍），但依赖大鼠肝细胞（RL34）条件培养基提供生长因子，且仅验证两个循环。Defendi-Cho和Gould测试了Chlorella vulgaris提取物（CVE）直接替代FBS，最佳配方结合胰岛素和生长因子后达到约75% FBS活力，表明单纯添加藻类提取物不足以完全复制FBS生物活性。
Optimized CCC systems：Haraguchi等代谢工程改造Synechococcus sp. PCC 7002表达乳酸脱氢酶和乳酸通透酶，12天内减少乳酸68%、氨98%，但葡萄糖和谷氨酰胺逐渐消耗，且未设FBS对照。Chu等使用transwell共培养RL34细胞和乳酸同化蓝细菌Synechococcus KC0110，实现C2C12增殖超3倍且无需换液，但仍依赖初始含FBS粘附步骤。Yamanaka等比较酸水解提取（AHE）和超声分馏提取（UFE）对CVE的影响，发现UFE保留谷氨酰胺和天冬酰胺，优化后条件培养基（CVNM）中IGF-1水平与DMEM条件培养基相当，但IGF-2更高，且MYOD和MYF5表达仍不足以完全复制FBS驱动的肌原性增殖。Dong等使用Auxenochlorella pyrenoidosa提取物（APE）补充于Carassius auratus肌细胞，5% APE优于10% FBS，增殖和MyoD表达增强，蛋白组学鉴定239种蛋白，涉及细胞代谢、信号转导等。
Current limitations and future research directions in CCC systems：当前限制包括葡萄糖和谷氨酰胺的逐渐消耗、生长因子依赖饲料细胞（如RL34）、缺乏物种相关细胞验证（主要用C2C12小鼠成肌细胞）、无生命周期评估（LCA）或技术经济分析（TEA）。未来需工程化固氮或分泌葡萄糖的菌株、开发化学定义粘附因子、用重组或植物源生长因子替代饲料细胞条件培养基、在物种相关卫星细胞上验证、在生物反应器中测试规模，以及结合LCA和TEA定量评估。
Biomolecule extraction and testing：包括从微藻和农业副产物中提取生物活性分子。
Ghosh等从Anabaena sp. PCC 7120超声提取藻蓝蛋白，在C2C12和QM7细胞中促进增殖，但高浓度（200 μg/mL）有细胞毒性。同样，从C. littorale提取物在C2C12、3T3和CHO细胞中促进增殖，但CHO细胞在传代后逐渐下降。
Side streams as source of biomolecules：Stout等评估油籽蛋白分离物（OPIs），包括印加花生、大豆、油菜籽和棉籽，其中油菜籽蛋白分离物（RPI）在牛卫星细胞（BSCs）中表现最佳，0.4 mg/mL时优于重组白蛋白15%，配方Beefy-R在4次传代中实现11.7群体倍增（vs. 白蛋白基Beefy-9的10.6），但低于FBS补充的GM（14.8）。然而，肌原性标记分析显示，Beefy-R导致过早分化，肌球蛋白重链（MHC）升高3倍，表明在扩增过程中驱动细胞向分化状态转变。
Fermented side streams：Kim等评估发酵豆粕水解物（FAB和FB），其中FB-H在0.1%浓度下实现75% FBS减少，维持PAX7表达并上调MYF5/MYOD，但第四代后生长偏离FBS对照。Teng等对发酵豆渣进行超滤，50 kDa组分在HEK293、HepG2、C2C12和猪成肌细胞中达到70%相对生长效率，短发酵（24 h）优于长发酵（72 h）。
Enzymatic protein extraction：Flaibam和Goldbeck优化酶法提取，两步法（中性pH后碱性pH 10）结合Viscozyme L处理，使大豆蛋白产量提高930%、花生蛋白提高698%，但未进行细胞测试。Mi等比较多种蛋白酶（alcalase、protease、neutrase、flavourzyme）对大豆和小麦水解物的影响，优化配方支持高达70% FBS减少，PAX7表达与增殖同步，融合指数保持。Chen等测试大豆蛋白水解物PU041，在C2C12中增强增殖和肌原分化标记（MHC、MyoD、MyoG）。
Current limitations and future research directions in biomolecule extraction and testing：当前限制包括增殖率低于10% FBS（次优）、过早分化（多代培养中）、提取方法缺乏标准化（不同酶、温度、pH等）、批次间变异（原料来源和加工条件）、安全性评估缺失（微生物污染、霉菌毒素、过敏原）、细胞类型偏倚（主要用C2C12，少数用原代卫星细胞，仅一项用鱼类细胞）、无生命周期评估或技术经济分析。未来需标准化提取和表征方案、研究过早分化机制、进行多代长期培养验证、在物种相关原代细胞上测试、评估批次变异、整合LCA和TEA，以及探索植物提取物与最小重组生长因子协同补充。
Addressing premature differentiation in serum-reduced cultures：Katayama等发现甲基-β-环糊精（MβCD）通过胆固醇耗竭抑制C2C12成肌细胞过早分化，在无血清条件下维持增殖能力。主成分分析显示，MβCD处理组在分化第3天仍保持类第1天表型，而对照组进入高级肌原分化。MβCD介导的细胞凋亡减少是其抑制分化的潜在机制，提示胆固醇耗竭策略可用于维持肌原细胞增殖。
Methodological strength and limitations：机器学习辅助分类（BERTopic）减少了手动筛选偏差，提高了可重复性，但存在局限性：文献检索限于英文和开放获取，可能引入选择偏倚；纳入研究异质性大（细胞类型、提取方法、培养条件等），无法进行定量荟萃分析；仅聚焦于植物基和循环方法类别，未分析其他类别。
Conclusion：CCC系统在减少资源消耗和环境影响方面具有潜力，通过微藻和蓝细菌实现培养基回收和代谢物修复，但需解决营养消耗和生长因子依赖问题。侧流价值化展示了农业副产物蛋白分离物支持肌原细胞增殖的可行性，但面临过早分化、提取方法标准化缺乏、生命周期评估缺失等挑战。未来应优先整合标准化提取方案、优化长期培养条件、进行规模化验证，并评估环境和经济可行性。
