预测阿尔茨海默病中相关的小胶质细胞相关细胞-细胞通讯通路：SPP1的作用

《GLIA》：Predicting Relevant Microglia-Associated Cell–Cell Communication Pathways in Alzheimer's Disease: A Role for SPP1

　　

小胶质细胞在阿尔茨海默病（AD）的病理生理学中起关键作用，其增加的异质性可能影响疾病进展。研究人员先前识别了在AD供体中富集且分别与淀粉样蛋白和tau相关的小胶质细胞特征。在此，研究人员从死后对照和AD病例生成了一份snRNAseq数据集，并分析了可能与AD病理生理学相关的细胞-细胞通讯通路的改变。AD病例中一个受扰动的信号通路涉及SPP1，尽管该通路在对照样本中也存在，但小胶质细胞-小胶质细胞SPP1信号传导仅限于AD供体。在小胶质细胞-小胶质细胞信号传导的进一步分析中，预测了AD特异性诱导的GAS6-AXL信号传导（来自炎症性和核糖体小胶质细胞）以及SPP1-ITGAV/ITGB5信号传导（来自疾病相关性和炎症性小胶质细胞等）。这些发现可能部分解释AD中描述的小胶质细胞吞噬活性增加。RNAscope证实了AD脑组织样本中淀粉样斑块附近SPP1表达小胶质细胞的富集。这些数据表明AD脑中小胶质细胞之间的细胞通讯发生了改变。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆形式，其神经病理学特征为β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和神经原纤维tau缠结的聚集。过去二十年的研究强调了神经炎症在AD病理生理学中的重要作用，而小胶质细胞（microglia）作为脑实质中的常驻免疫细胞，通过全基因组关联研究被证实表达AD风险基因，并强烈响应Aβ斑块和tau病理。小胶质细胞对这些病理特征的吞噬和神经炎症反应可能导致其参与AD中的神经退行性变。单细胞转录组技术的进步帮助研究人员更好地理解小胶质细胞如何响应并促进AD等神经退行性疾病，但大多数研究集中于描述小胶质细胞转录状态的谱系。此前，研究人员通过荧光激活核分选（FANS）对死后冷冻样本进行非神经元和非少突胶质细胞谱系核富集，进行了单核RNA测序（snRNAseq），识别出两种不同的小胶质细胞状态，其相对丰度分别与Aβ和tau病理程度相关。然而，由于原始研究中的胶质细胞富集，无法充分探讨小胶质细胞相关的细胞-细胞相互作用在疾病中如何受影响。因此，本研究旨在补充原数据集，结合新生成的神经元和少突胶质细胞富集snRNAseq数据，利用生物信息学工具预测细胞-细胞相互作用，以揭示AD中可能改变的小胶质细胞相关通讯通路。

**研究方法与结论**

研究人员使用从10例（5例对照，5例AD）死后枕颞皮层新鲜冷冻脑组织样本，通过FANS分选NEUN+（神经元）、OLIG2+（少突胶质细胞）和双阴性核，构建了神经元和少突胶质细胞富集的snRNAseq数据集（新增99,127个核）。与原胶质细胞富集数据集（Gerrits et al. 2021）整合后，共获得469,482个核，涵盖所有主要中枢神经系统（CNS）细胞类型。利用CellChat v2.2.0.9001预测细胞-细胞通讯，分析对照与AD组间的信号通路差异。此外，在另一队列（12例样本：4例对照，8例AD）的FFPE顶叶皮层组织上，通过RNAscope原位杂交结合免疫荧光（IBA1和Aβ抗体）验证SPP1表达。图像分析采用ImageJ和QuPath，计算H评分（histology score）并测量SPP1+/IBA1+核与Aβ斑块的距离。主要技术方法包括：snRNAseq数据生成与整合、CellChat细胞通讯预测、RNAscope与免疫荧光共定位验证，样本来源为比利时Born-Bunge研究所神经生物库和荷兰脑库。

**研究结果**

**3.1 生成互补的snRNAseq数据集以研究AD中的细胞相互作用组**：通过补充神经元和少突胶质细胞富集数据，整合后成功识别出所有主要CNS细胞类型。兴奋性神经元被分为上层（第2/3层）和深层（第6层）神经元，且在AD供体中观察到第2/3层兴奋性神经元比例显著下降，第6层比例上升，与浅层神经元易损性一致。未发现抑制性神经元亚型比例在AD与对照间有差异。

**3.2 预测AD中小胶质细胞-小胶质细胞SPP1信号增加**：CellChat分析显示，AD中微胶质细胞与其他细胞类型（如CNS相关巨噬细胞CAMs、内皮细胞、淋巴细胞、白质星形胶质细胞）的相互作用增强，尤其是小胶质细胞-小胶质细胞通讯增加。在微胶质细胞作为发送者的通路中，SEMA4信号仅在对照中检测到（微胶质细胞表达SEMA4D靶向星形胶质细胞的PLXNB1受体）。在微胶质细胞作为接收者的通路中，TULP通路（配体TUB通过MERTK受体信号）仅在对照中检测到，而SPP1通路（配体SPP1通过ITGAV/ITGB5受体）仅在AD中检测到，配体来源于CAMs、少突胶质细胞和小胶质细胞。此外，AD中ADGRE和TGFβ信号强度增加，而Netrin和APP信号改变。

**3.3 AD中的小胶质细胞-小胶质细胞SPP1信号**：对158,836个微胶质细胞核进行亚聚类，识别出8种转录状态（稳态、疾病相关、炎症性、应激反应、抗原呈递、干扰素反应、增殖、核糖体反应）。微胶质细胞-微胶质细胞CellChat分析识别出7条通路，其中SPP1和GAS通路仅在AD中检测到：SPP1信号由疾病相关、炎症性、应激反应、增殖和核糖体反应微胶质细胞发送，靶向增殖微胶质细胞；GAS信号由炎症性和核糖体反应微胶质细胞通过GAS6配体发送至所有微胶质细胞状态（经AXL受体）。对照中特有的通路包括CD45和TGFβ信号。MPZ通路在两组中均存在，但方向不同。

**3.4 SPP1表达髓系细胞在AD脑中增加**：RNAscope验证显示，AD供体样本中SPP1+/IBA1+双阳性核数量显著高于对照，且H评分更高。SPP1+/IBA1+核的密度在靠近Aβ斑块区域最高，提示SPP1表达与病理近端相关。

**讨论与结论**

本研究通过整合snRNAseq数据集并预测细胞-细胞通讯，揭示了AD中微胶质细胞-微胶质细胞通讯增强，特别是SPP1信号通路在AD中特异性激活。结合RNAscope验证，证实SPP1表达髓系细胞在AD脑内增加，且富集于淀粉样斑块附近。讨论部分指出：AD中丧失的TULP通路（与神经元损失相关）和SEMA4通路（影响星形胶质细胞-微胶质细胞相互作用）可能反映突触稳态失调；增加的TGFβ信号可能具有保护性；ADGRE通路可能参与淋巴细胞招募。微胶质细胞-微胶质细胞通讯中，SPP1和GAS通路均与吞噬功能相关，可能解释AD中微胶质细胞吞噬活性增强。SPP1作为一种分泌性基质相关糖蛋白，在多种神经病理状态下上调，其激活可能通过整合素受体促进Aβ清除。研究结论翻译如下：
“总之，我们的数据代表了AD神经病理和神经退行过程中微胶质细胞与其他微胶质细胞及胶质细胞之间相互作用的潜在机制。然而，这些信号通路在体内随疾病进展的时间动态变化，以及任何此类补偿机制的有效性和后果仍有待确定。此外，这些预测的相互作用可能需要在空间上邻近的细胞中发生。虽然snRNAseq数据制备过程中丢失了空间信息，但适应新兴空间转录组平台的细胞-细胞通讯工具有助于突出疾病中真正生物学相关的信号通路。我们期待未来的研究进一步阐明SPP1信号调节AD病理生理学的潜力。”