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神经元、胶质细胞和血管之间的协调信号对于神经系统发育至关重要。在发育中的视网膜中，自发性胆碱能视网膜波是血管早期成熟过程中神经活动的主要来源。在此，研究人员检验了视网膜波影响血管生成和胶质-血管界面成熟的假说。研究人员首先发现，在缺乏β2亚基烟碱型乙酰胆碱受体
神经元、胶质细胞和血管之间的协调信号对于神经系统发育至关重要。在发育中的视网膜中，自发性胆碱能视网膜波是血管早期成熟过程中神经活动的主要来源。在此，研究人员检验了视网膜波影响血管生成和胶质-血管界面成熟的假说。研究人员首先发现，在缺乏β2亚基烟碱型乙酰胆碱受体（β2-containing nicotinic acetylcholine receptor, β2-nAChR）介导的视网膜波的小鼠中，视网膜血管正常生长，表明早期自发性活动并非血管生成所必需。接下来，研究人员研究了Müller胶质细胞如何在发育中的胶质-血管界面上建立信号传递。稀疏标记和免疫组织化学揭示，Müller胶质细胞的侧突在中间层和深层血管生成过程中与内皮尖端细胞紧密关联，并从血管生长的最早阶段在血管接触位点建立富含水通道蛋白-4（Aquaporin-4, AQP4）的终足。这些关联在整个发育过程中保持稳定，甚至在Piezo2条件性敲除小鼠中侵入血管轨迹被破坏时仍然存在。为了确定血管界面处的胶质信号是否与视网膜波耦合，研究人员将双光子钙成像与视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGC）电压钳记录相结合。Müller胶质细胞终足表现出强健的、区室化的钙瞬变，这些瞬变在很大程度上与视网膜波不相关。尽管用加巴嗪（gabazine）阻断GABA-A受体增加了所有胶质区室中与波相关的活动，但大多数终足钙信号仍然与波无关。总之，这些发现支持一个模型，即血管生成和Müller胶质细胞-血管界面的建立均通过波独立的发育程序进行。
**发育视网膜中Müller胶质细胞-血管相互作用的研究解读**
**研究背景与问题**
在神经系统发育过程中，神经元、胶质细胞和血管之间的协调信号是构建健康神经系统的关键。视网膜是研究这一相互作用的理想模型，因为其血管发育异常会导致早产儿视网膜病变等视力丧失疾病。视网膜血管分为三个平面层：浅层、中间层和深层，由垂直的侵入血管连接。已知神经活动在视网膜血管生成中具有层特异性作用：多巴胺能信号抑制浅层血管生长，胆碱能活动对深层血管发育至关重要，谷氨酸能信号通过诱导Müller胶质细胞中的促血管生成因子促进深层血管生成。然而，自发性的胆碱能视网膜波（出生后第一周的主要神经活动形式）是否直接影响血管生成以及Müller胶质细胞-血管界面的建立，尚不清楚。现有研究存在矛盾：急性药理学或毒素破坏胆碱能信号会显著损害深层血管成熟，而遗传学扰动仅产生温和效应。此外，Müller胶质细胞在发育过程中通过与血管的直接物理接触和钙信号传递发挥作用，但其在血管界面的信号是否受视网膜波调控，仍是未知。因此，研究人员开展本研究，旨在检验视网膜波是否影响血管生成和胶质-血管界面成熟的假说。
**研究内容与结论**
研究人员利用多种小鼠模型、免疫组织化学、稀疏标记、双光子钙成像结合电生理记录等方法，系统研究了发育视网膜中Müller胶质细胞与血管的相互作用。主要结论：1）胆碱能视网膜波并非血管生成所必需，因为β2-nAChR敲除小鼠的血管密度和尖端细胞正常；2）Müller胶质细胞在血管生成早期即与内皮尖端细胞建立联系，并形成富含AQP4的终足，且这种联系在血管轨迹异常时仍保持稳定；3）Müller胶质细胞终足表现出区室化的钙瞬变，这些钙信号与视网膜波不相关，且与同源茎部钙信号独立。这些发现支持一个模型：血管生成和Müller胶质细胞-血管界面的建立均通过波独立的发育程序进行。该研究论文发表在《GLIA》。
**关键技术方法**
研究人员使用的主要关键技术方法包括：1）利用Chrnb2 (β2-nAChR) 组成性敲除小鼠（来源于JAX实验室）和Six3-Cre;Piezo2
fl/fl条件性敲除小鼠（来源于JAX）来分别缺失视网膜波和扰乱血管轨迹；2）采用GLAST-CreER;MORF3稀疏标记小鼠（JAX）结合抗V5抗体免疫组化，以单细胞分辨率观察Müller胶质细胞的形态；3）通过免疫组化标记CD31（内皮细胞）、ESM1（尖端细胞）、GLAST（Müller胶质细胞）和AQP4（终足）进行共聚焦成像；4）使用双光子钙成像（Calbryte 520 AM负载）同时记录RGC电压钳电流，以检测Müller胶质细胞不同区室的钙瞬变与视网膜波的相关性；5）应用加巴嗪（GABA-A受体拮抗剂）增强神经递质溢出，以探讨波相关活动的潜在影响。所有样本均来自小鼠，未涉及人类队列。
**研究结果**
**3.1 视网膜血管独立于胆碱能视网膜波均匀生长**
研究人员通过CD31免疫组化标记野生型和β2-nAChR敲除小鼠出生后第5天（P5）至第14天（P14）的视网膜血管，量化了血管密度（单位面积血管长度）。结果显示，在P5和P8，β2-nAChR敲除小鼠的浅层血管密度与野生型相当，且浅层、中间层和深层血管在中心区和周边区的生长进程均未改变。尖端细胞标记ESM1的荧光强度在P3和P5也无差异。因此，胆碱能视网膜波的缺失不影响血管生成的时序和层特异性组织。
**3.2 Müller胶质细胞与活跃生长的血管关联并早期建立终足覆盖**
通过GLAST和CD31免疫组化，研究人员发现Müller胶质细胞侧突在深层血管生成过程中与内皮尖端细胞紧密接触。MORF稀疏标记小鼠显示，在P11的深层和中间层血管生成中，Müller胶质细胞侧突与尖端细胞的前沿丝状伪足形成接触点。AQP4免疫组化定量显示，从血管生长的最早阶段（P5）到成年，Müller胶质细胞终足对血管的覆盖百分比在中间层和深层均无显著变化，且与成年水平相当。在Piezo2条件性敲除小鼠（Six3-Cre;Piezo2
fl/fl）中，虽然侵入血管轨迹异常，但在侵入区（PZ）的AQP4覆盖百分比仍保持不变。这表明Müller胶质细胞动态跟随生长中的血管并建立成熟终足，且该过程对血管轨迹扰动具有稳健性。
**3.3 Müller胶质细胞终足的钙信号是区室化的且独立于视网膜波**
研究人员在P9-P12野生型小鼠视网膜上进行双光子钙成像，同时记录RGC的波相关EPSCs。将Müller胶质细胞区室分为茎部、侧突和终足。结果显示，所有区室均表现出自发钙瞬变（频率约0.5-3次/分钟），但终足中与视网膜波相关的钙瞬变比例极低，置换检验仅发现少数终足ROI显著相关。加巴嗪（5μM）增加EPSC的积分电流，提高了茎部钙瞬变与波的相关性，但在终足中仅P9-P10阶段有少数ROI出现波相关活动，P11-P12阶段则罕见。此外，对12对茎-终足配对的分析显示，大多数钙瞬变在茎部和终足中独立发生，只有7/127个终足事件与茎部相关，且其中仅1个与波相关。因此，Müller胶质细胞终足作为独立的钙信号区室，其活动主要不依赖于视网膜波。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究证明在β2-nAChR敲除小鼠中，视网膜血管发育的时序和层组织未受影响，表明胆碱能视网膜波不是血管生成所必需的。这与之前通过SAC消融（抗ChAT-SAP毒素）导致深层血管缺陷的结果不一致，提示SAC消融可能通过非β2-nAChR途径（如其他神经递质或生长因子释放）影响血管。Müller胶质细胞-血管界面在发育早期即建立，且AQP4覆盖水平与成年类似，这与大脑中星形胶质细胞终足逐渐覆盖血管的模式不同，反映了视网膜中胶质成熟与血管生长在时间上重叠的特点。Müller胶质细胞侧突与尖端细胞的接触暗示其可能发挥局域引导作用，但血管并非沿Müller胶质细胞茎部生长，排除了简单的“茎部模板”模型。终足中区室化的钙信号独立于视网膜波，且与同源茎部不相关，表明Müller胶质细胞-血管界面在结构上和功能上均具有早期特化，其活动主要通过波独立程序调控。
**研究结论翻译**：这些发现共同支持了一个模型，即血管生成和Müller胶质细胞-血管界面的建立均通过波独立的发育程序进行。
