《CNS Neuroscience & Therapeutics》：N6-Methyladenosine Demethylase FTO Mitigates Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury by Suppressing AQP4 Expression
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目的：在急性缺血性卒中患者中，再灌注治疗可能损害血脑屏障，导致继发性脑缺血再灌注损伤（CIRI）。本研究探讨了N6-甲基腺苷（m6A）去甲基酶FTO在CIRI发病机制中的作用，并探究了潜在的分子机制。方法：研究人员在体内建立了大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型
目的：在急性缺血性卒中患者中，再灌注治疗可能损害血脑屏障，导致继发性脑缺血再灌注损伤（CIRI）。本研究探讨了N6-甲基腺苷（m6A）去甲基酶FTO在CIRI发病机制中的作用，并探究了潜在的分子机制。方法：研究人员在体内建立了大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型，在体外建立了原代星形胶质细胞的氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型。结果：在体内和体外CIRI模型中，FTO表达均显著下调。通过质粒转染上调FTO可显著减轻细胞损伤并增强星形胶质细胞活力。在分子水平上，m6A修饰的转录本在脑缺血再灌注期间富集于MAPK信号通路。值得注意的是，热休克蛋白家族A（Hsp70）成员1A（Hspa1a）被鉴定为关键靶点。FTO表达降低导致Hspa1a mRNA上的m6A甲基化水平升高，从而促进其降解。此外，由FTO沉默诱导的细胞损伤可通过Hspa1a过表达或水通道蛋白-4（AQP4）沉默来缓解。结论：本研究证明FTO通过稳定Hspa1a mRNA来抑制AQP4表达，从而减轻CIRI。因此，FTO代表了缺血性卒中治疗的一个有前景的治疗靶点。
**论文解读：FTO通过m6A修饰调控Hspa1a/NF-κB/AQP4轴减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究**
**研究背景与问题提出**
急性缺血性卒中（AIS）是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因。再灌注治疗虽能恢复梗死区域的血氧供应，但可能破坏血脑屏障，引发继发性脑缺血再灌注损伤（CIRI），加重神经细胞凋亡或坏死，扩大脑梗死体积，并导致高致残率、复发率和死亡率。目前，对CIRI机制的深入探索及新型治疗靶点的发现是临床迫切需求。N6-甲基腺苷（m6A）甲基化是RNA中最常见的转录后修饰，参与氧化应激、凋亡和自噬等关键细胞过程。已有研究表明，脑缺血再灌注后m6A修饰水平、分布及相关基因表达谱发生显著改变。FTO作为关键m6A去甲基酶，已被证实可通过降低灰质和白质损伤、促进运动功能和认知恢复来减轻CIRI，但其具体分子机制尚未完全阐明。此外，有研究显示，CIRI后转录组中m6A修饰的mRNA富集于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，其中热休克蛋白家族A成员1A（Hspa1a）作为该通路的关键基因，可通过抑制NF-κB转录活性减轻炎症反应。然而，FTO介导的m6A修饰如何调控Hspa1a及其下游效应在CIRI中的作用仍不清楚。
**研究内容与主要结论**
研究人员通过体内小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型和体外原代星形胶质细胞氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型，系统探究了FTO在CIRI中的作用机制。研究发现，FTO在CIRI模型中表达显著下调；上调FTO可减轻细胞损伤、增强星形胶质细胞活力，并减少脑梗死体积、改善神经功能缺损。在分子机制上，通过甲基化RNA免疫共沉淀测序（MeRIP-seq）和KEGG通路富集分析，发现MAPK信号通路中Hspa1a的m6A修饰水平在CIRI后显著升高。FTO表达降低导致Hspa1a mRNA上m6A甲基化增加，促进其降解，进而降低HSPA1A蛋白水平。HSPA1A的减少减弱了对NF-κB的抑制作用，导致NF-κB激活，上调水通道蛋白-4（AQP4）表达，加重CIRI。进一步的功能实验证实，Hspa1a过表达或AQP4沉默可逆转FTO沉默引起的细胞损伤。该研究揭示了FTO通过调控Hspa1a m6A修饰，经HSPA1A/NF-κB/AQP4轴减轻CIRI的分子机制，为缺血性卒中提供了新的治疗靶点。论文发表在《CNS Neuroscience》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法：1）体内模型：建立雄性C57BL/6J小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型，通过TTC染色评估脑梗死体积，Bederson评分评估神经功能缺损，免疫组化和HE染色观察组织病理学变化。2）体外模型：从小鼠小脑分离原代星形胶质细胞（MA-C），建立氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型。3）分子生物学技术：采用Western blotting和qPCR检测FTO、HSPA1A、NF-κB、AQP4等蛋白和mRNA表达；利用甲基化RNA免疫共沉淀测序（MeRIP-seq）分析m6A修饰变化；通过siRNA转染敲低FTO或AQP4，使用质粒或腺相关病毒（AAV）过表达FTO。4）细胞功能检测：CCK-8和EdU检测细胞活力，LDH释放评估细胞损伤，流式细胞术检测细胞凋亡。样本来源：C57BL/6J小鼠购自南京集萃药康生物科技有限公司。
**研究结果**
**3.1 MCAO/R导致FTO低表达**：通过qPCR检测发现，MCAO/R后小鼠脑组织中m6A修饰水平先升高（6小时达峰）后下降；在m6A相关酶中，FTO表达下降最显著，Western blotting证实FTO蛋白水平同步降低。
**3.2 FTO保护CIRI**：在OGD/R模型中，FTO表达随时间显著下降。FTO siRNA敲低导致细胞活力下降、LDH释放增加和凋亡增多；而FTO过表达质粒可逆转这些损伤。在MCAO/R小鼠中，FTO过表达显著减少脑梗死体积并改善Bederson神经功能评分，且与siAQP4联用效果更佳。
**3.3 Hspa1a mRNA m6A修饰介导FTO在MCAO/R和OGD/R模型中的作用**：MeRIP-seq结果显示，CIRI后整体m6A水平下降，与体外结果一致。KEGG分析表明MAPK通路基因（包括Hspa1a）的m6A修饰变化最显著。MCAO/R后HSPA1A蛋白和mRNA表达降低。FTO敲低进一步降低Hspa1a表达，而FTO过表达则升高其表达。在OGD/R模型中，Hspa1a mRNA不同位点的m6A修饰水平升高，但FTO敲低后这些升高水平显著降低，提示FTO减少导致Hspa1a mRNA高甲基化并促进其降解。
**3.4 FTO调节MCAO/R和OGD/R后的HSPA1A/NF-κB/AQP4轴**：qPCR显示，FTO过表达降低NF-κB和AQP4表达，FTO敲低则相反。Western blotting证实，FTO过表达上调HSPA1A、下调NF-κB和AQP4；FTO敲低则效果相反。免疫组化结果在MCAO/R小鼠中一致。功能实验表明，FTO敲低导致的OGD/R损伤可通过Hspa1a过表达或AQP4沉默来缓解，细胞活力和LDH释放及凋亡检测均支持这一结论。
**讨论与结论**
本研究证实，FTO在CIRI后显著下调，导致Hspa1a mRNA的m6A甲基化水平升高，促进其降解，进而降低HSPA1A蛋白。HSPA1A的减少削弱了对NF-κB的抑制，导致NF-κB激活，上调AQP4表达，加重CIRI。FTO过表达通过稳定Hspa1a mRNA，抑制NF-κB和AQP4，从而减轻脑损伤。研究结论部分强调：FTO水平在CIRI后显著下调，导致Hspa1a mRNA的m6A甲基化增加并促进其降解；HSPA1A的缺失导致NF-κB和AQP4表达上调，从而加重CIRI。这些发现将FTO/HSPA1A/NF-κB/AQP4轴确定为潜在治疗靶点，为缺血性卒中的新治疗策略提供了理论基础。
