《Cancer Science》：A Melanoma Transplanted in Nude Mice Has Both Host- and Tumor-Derived Blood Vessel- and Nerve-Like Structures
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位于毛囊隆突区的巢蛋白(nestin)表达干细胞可分化为多种细胞类型。研究人员将红色荧光蛋白(RFP)标记的人SK-MEL-5黑色素瘤细胞皮下移植入巢蛋白驱动绿色荧光蛋白(ND-GFP)裸鼠体内。ND-GFP阳性细胞分化为CD31阳性内皮细胞、αSMA阳性周细
位于毛囊隆突区的巢蛋白(nestin)表达干细胞可分化为多种细胞类型。研究人员将红色荧光蛋白(RFP)标记的人SK-MEL-5黑色素瘤细胞皮下移植入巢蛋白驱动绿色荧光蛋白(ND-GFP)裸鼠体内。ND-GFP阳性细胞分化为CD31阳性内皮细胞、αSMA阳性周细胞及βIII-tubulin阳性神经元，在移植黑色素瘤内形成血管样与神经样结构。靶向血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体贝伐珠单抗(bevacizumab)抑制了肿瘤内巢蛋白阳性血管样及神经样结构的形成，但未显著抑制肿瘤生长。贝伐珠单抗处理后，移植瘤内表达CD31、αSMA和βIII-tubulin的血管样及神经样结构在不表达巢蛋白的情况下形成，但仍维持RFP阳性，提示其由黑色素瘤细胞转分化而来。小鼠经贝伐珠单抗处理后，黑色素瘤内VEGFA相对mRNA表达显著降低，而血管相关标志物VEGFR2和FGF6显著升高；神经相关标志物Tuj1、BDNF和IGF1的mRNA表达亦显著升高。贝伐珠单抗处理组中巢蛋白未检出而RFP保留于血管样及神经样结构，表明这些结构源于黑色素瘤细胞转分化。本研究提示宿主与癌细胞均可向黑色素瘤内血管样及神经样结构分化。
研究背景与立项依据
毛囊相关多能(HAP)干细胞表达巢蛋白(nestin)，定位于毛囊隆突区，可跨胚层分化为角质形成细胞、神经元、心肌细胞及内皮细胞等。已有研究在ND-GFP转基因裸鼠中证实，宿主HAP干细胞可参与移植肿瘤的血管生成与神经发生。然而，在抗血管生成药物压力下，肿瘤细胞本身是否具备向血管样及神经样结构转分化的能力，以及宿主与肿瘤双源结构在瘤内的动态消长规律，尚缺乏在体可视化证据。该研究以人BRAF突变SK-MEL-5黑色素瘤为模型，利用双色荧光示踪体系，探讨宿主HAP干细胞与肿瘤细胞各自对瘤内血管样/神经样结构的贡献，并评估贝伐珠单抗(bevacizumab)的干预效应，论文发表于《Cancer Science》。
主要关键技术方法
研究采用ND-GFP裸鼠皮下移植RFP稳定表达SK-MEL-5细胞的双荧光示踪模型；治疗组腹腔注射贝伐珠单抗(10 mg/kg，每周两次，共14天)。可视化依靠整体荧光成像与免疫荧光多重染色（抗GFP、抗RFP、抗CD31、抗αSMA、抗βIII-tubulin）。分子水平采用定量实时PCR检测VEGFA、VEGFR2、FGF6、Tuj1、BDNF、IGF1、HIF1α、BMP2相对表达（以GAPDH归一）。临床验证部分纳入北里大学医院28例Breslow厚度≥4 mm与20例<4 mm原发性恶性黑色素瘤石蜡标本进行同源免疫荧光定量。统计分析采用单尾非配对Student t检验（Welch校正）及双因素重复测量ANOVA。
研究结果
3.1 宿主HAP干细胞在移植黑色素瘤中形成血管样与神经样结构
移植42天后，瘤周皮下nestin-GFP面积显著高于对侧正常皮肤(p=2.90×10?2)；瘤内可见nestin-GFP连续从宿主血管/神经伸入瘤体，并形成nestin-CD31、nestin-αSMA、nestin-βIII-tubulin双阳管状/网状结构，证明宿主HAP干细胞分化为内皮、周细胞及神经元样细胞。
3.2 移植瘤内nestin阳性血管样与神经样结构随肿瘤生长扩增
21天至42天瘤体积增大(p=1.43×10?2)，瘤内nestin-GFP总面积及三类双阳细胞数同步上升（p均<0.01），表明宿主源结构随瘤进展增多。
3.3 贝伐珠单抗抑制移植瘤内nestin阳性血管样与神经样结构
治疗14天瘤体积无差异(p=7.90×10?2)，但瘤缘nestin-GFP面积缩短(p=2.92×10?3)，nestin-GFP/CD31、/αSMA、/βIII-tubulin双阳细胞数下降；与此同时nestin阴性但CD31、αSMA、βIII-tubulin阳性细胞数上升，提示宿主源被抑制后非宿主源结构浮现。
3.4 贝伐珠单抗处理改变瘤内血管与神经相关mRNA并显露肿瘤细胞转分化
qPCR显示VEGFA下调(p=0.017)，VEGFR2(p=0.001)、FGF6(p=0.018)上调；神经标志Tuj1(p=0.032)、BDNF(p=0.014)、IGF1(p=0.001)上调；HIF1α(p=0.017)、BMP2(p=0.011)上调。免疫荧光示RFP-CD31、RFP-αSMA、RFP-βIII-tubulin双阳细胞在治组增多（p<0.05），且无非宿主nestin-GFP信号，支持黑色素瘤细胞转分化为血管/神经样结构。
3.5 人黑色素瘤中nestin阳性血管样与神经样结构随厚度演变
人标本中nestin-CD31、nestin-αSMA双阳数在<4 mm瘤多于≥4 mm瘤（p<0.01），而nestin-βIII-tubulin双阳数在≥4 mm瘤更多(p=7.49×10?3)，提示薄瘤以宿主血管样为主，厚瘤继发神经样增生。
讨论与结论翻译
讨论指出，ND-GFP裸鼠模型下宿主nestin阳性细胞随黑色素瘤生长持续伸入瘤内分化为内皮、周细胞及神经元样成分；贝伐珠单抗压制宿主源nestin结构后，保留RFP的肿瘤细胞转而表达CD31/αSMA/βIII-tubulin，呈现转分化补偿。裸鼠免疫缺陷微环境限制需在未来免疫健全模型中验证。结论原文意译：本研究提示，在黑色素瘤中宿主细胞与癌细胞均可分化为血管样及神经样结构；抗VEGF治疗虽不缩减瘤体，但迫使肿瘤依赖自身转分化维持伪血管/伪神经网络，这一现象为理解黑色素瘤基质重塑及耐药机制提供了双源分化视角。
（全文约1480字）
