Fc优化的GITR抗体增强CD4+ T细胞-树突状细胞相互作用以促进抗肿瘤免疫

《Nature Cancer》：Fc-optimized GITR antibody enhances a CD4 T cell–dendritic cell crosstalk to promote antitumor immunity

　　

靶向刺激性免疫检查点糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（GITR）的激动性单克隆抗体（mAbs）是癌症免疫治疗的一种有前景的策略，可激活效应T细胞并消除调节性T细胞。抗GITR mAbs的抗肿瘤活性依赖于可结晶片段（Fc）结构域与其受体（FcγRs）的结合；然而，这在人类抗GITR mAbs中尚未得到全面研究。在此，研究人员使用Fc蛋白和糖基工程来修饰抗GITR人mAbs的FcγR相互作用，并在人源化小鼠中对其进行表征。研究人员鉴定了一种Fc优化的人IgG支架，通过多种FcγR介导的机制增强抗肿瘤功效，包括调节性T细胞耗竭以及CD4⁺ T细胞和树突状细胞的相互参与和激活，导致CD4⁺ T细胞的抗肿瘤细胞毒性和增强的CD8⁺ T细胞活性。研究人员的发现提示了一种优化人抗GITR mAbs的策略，利用有益的免疫途径来改善其治疗潜力。

**研究背景与问题**
靶向刺激性免疫检查点糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（GITR）的激动性单克隆抗体（mAbs）在临床前研究中展现出抗肿瘤潜力，但早期临床试验中疗效有限。其抗肿瘤活性依赖于可结晶片段（Fc）结构域与Fcγ受体（FcγRs）的相互作用，然而人类抗GITR mAbs的FcγR通路机制尚未被系统阐明。现有研究多基于小鼠或非人源IgG支架，无法准确模拟人类FcγR介导的效应，且不同FcγR亚型（激活型与抑制型）对疗效的贡献存在争议。因此，需要优化人IgG的Fc结构域，以增强抗GITR mAbs的治疗潜力。

**研究内容与结论**
研究人员通过Fc蛋白工程与糖基工程（定点突变、去岩藻糖基化等）构建了一系列人抗GITR Fc变体，并在表达人FcγR的人源化小鼠（hFcγR小鼠）中评估其抗肿瘤活性。鉴定出最优的Fc优化支架（G236A-aFuc，即GA-aFuc），其通过增强与激活型FcγRIIa和FcγRIIIa的双重结合，显著提升抗肿瘤疗效，优于临床级别的IgG1及Fc功能缺失变体（N297A）。该疗效依赖于FcγR通路，而与补体途径、药代动力学或GITR激动活性无关。机制上，Fc优化mAb通过FcγR介导的调节性T细胞（Treg）选择性耗竭（限于肿瘤微环境，不波及淋巴结和脾脏），并激活树突状细胞（DC），尤其是cDC1亚群，进而促进CD4⁺ T细胞与DC的物理桥接与相互作用，诱导CD4⁺ T细胞获得辅助和细胞毒性双重功能（MHC II依赖、接触依赖的抗原特异性杀伤），并增强CD8⁺ T细胞活性。该DC激活机制是抗GITR mAb特有的，不同于抗CD25、抗CCR8或抗CTLA4 mAb。此外，Fc优化mAb的疗效独立于GITR激动活性，进一步证实Fc效应功能的主导作用。该研究为优化人类抗GITR mAbs提供了策略，有助于改善其临床治疗潜力。论文发表在《Nature Cancer》。

**主要关键技术方法**
1. **Fc工程改造**：通过定点突变（N297A、G236A、V11等）和去岩藻糖基化（使用2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖）制备一系列人IgG1 Fc变体。
2. **人源化小鼠模型**：使用表达人FcγR（hFcγR）的转基因小鼠，以及FcγR敲除小鼠、C3补体敲除小鼠、ZBTB46-DTR和XCR1-iDTR条件性DC清除小鼠，进行体内药效评估。
3. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）**：对肿瘤微环境（TME）来源的CD45⁺免疫细胞进行测序，分析细胞亚群、基因表达差异及细胞间通讯网络。
4. **流式细胞术与成像流式细胞术**：分析T细胞、DC亚群频率、激活标志物及抗体在细胞内的定位，结合双细胞（doublet）分析揭示CD4⁺ T细胞–DC桥接。
5. **体外细胞杀伤实验**：从治疗小鼠淋巴结分离T细胞亚群，与肿瘤细胞共培养，评估抗原特异性、MHC II依赖的杀伤能力。
（样本来源：MC38、B16F10、MCA-205等小鼠肿瘤细胞系，以及人源化FcγR小鼠、C57BL/6小鼠、基因敲除小鼠等动物模型。）

**研究结果**
- **FcγRs介导抗GITR mAb的抗肿瘤活性**：通过比较不同Fc变体（Fc功能缺失型N297A、激活型增强变体G236A和aFuc、抑制型增强变体V11）在hFcγR小鼠中的疗效，发现激活型FcγR（IIa/IIIa）结合增强显著提升抗肿瘤效果，而抑制型FcγRIIb结合增强则削弱疗效，提示疗效与激活型/抑制型FcγR结合比率正相关。
- **Fc工程增强抗肿瘤免疫**：联合增强FcγRIIa和FcγRIIIa结合的GA-aFuc变体在多种肿瘤模型（MC38、B16、MCA-205）中均显示最优疗效，优于临床级IgG1和N297A，且诱导长期T细胞记忆。
- **补体途径或药代动力学不贡献GITR mAb的效力**：Fc变体清除率与受体占用率相似，FcγR敲除小鼠中疗效消失，且C3敲除小鼠中疗效不变，表明FcγR通路是关键，补体不参与。
- **Fc介导的Treg消除**：GA-aFuc和IgG1在TME中快速选择性耗竭Treg（尤其是活化型Treg亚群），而Fc功能缺失变体无效，scRNA-seq证实Treg–髓系细胞通讯减少。
- **DC介导Fc优化GITR mAb的治疗效果**：GA-aFuc显著增加肿瘤和引流淋巴结中DC的激活（CD80/CD86上调）及频率，依赖cDC1和cDC2亚群。条件性清除cDC（ZBTB46-DTR）或cDC1（XCR1-iDTR）后疗效消失。scRNA-seq显示GA-aFuc处理后的DC上调I型IFN应答、FcγR信号、吞噬、抗原加工呈递等通路基因。
- **CD4 T细胞与DC的相互作用使治疗效果成为可能**：CD4⁺ T细胞（而非CD8⁺ T细胞或NK细胞）清除后，DC激活和Treg耗竭均消失，且肿瘤控制失效。成像流式细胞术证实GA-aFuc在引流淋巴结中形成CD4⁺ T细胞–cDC2双细胞，抗体位于细胞接触界面，提示物理桥接。
- **Treg非依赖的DC激活是GITR mAb独有的**：与抗CD25、抗CCR8 mAb相比，抗GITR mAb的DC激活不依赖Treg耗竭，且抗CTLA4 mAb的疗效不依赖cDC，而抗GITR mAb的疗效严格依赖cDC。
- **Fc优化抗GITR mAb激发细胞毒性及效应CD4⁺ T细胞活性**：scRNA-seq显示GA-aFuc处理后的CD4⁺ T细胞上调细胞毒性基因（Gzma、Gzmb、Prf1等），体外实验证实CD4⁺CD25⁺ T细胞具有MHC II依赖、接触依赖的抗原特异性肿瘤细胞杀伤能力。
- **Fc优化GITR mAb的效力独立于GITR激动作用**：制备弱激动性双特异性抗GITR mAb（单臂结合GITR），在等效Treg耗竭剂量下，弱激动变体仍显著抑制肿瘤生长，且优于完全激动变体，而Fc功能缺失的弱激动变体完全无疗效，表明Fc效应功能而非GITR激动主导治疗活性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，抗GITR mAb的人类IgG支架在临床中效果不佳，是因为其在小鼠Fc–FcγR系统中有效的Fc依赖效应机制在人类IgG1中受损。本研究通过优化Fc结构域，重现了小鼠替代抗体的体内机制。Fc优化mAb通过双重机制（Treg耗竭和DC激活）发挥疗效，其中DC激活依赖于CD4⁺ T细胞–DC桥接，并诱导CD4⁺ T细胞获得细胞毒性功能。该机制不同于其他Treg耗竭抗体（抗CD25、抗CCR8、抗CTLA4），具有独特性。研究结论：功能性的CD4⁺ T细胞（兼具辅助和细胞毒性作用）对于Fc优化抗GITR mAb抑制肿瘤生长至关重要。本研究为优先开发Fc优化而非靶点优化的抗GITR mAbs提供了临床评估依据。