基因组监测揭示埃塞俄比亚不同传播环境中恶性疟原虫耐药变异的共现现象

《Nature Microbiology》：Genomic surveillance reveals co-occurrence of Plasmodium falciparum drug resistance variants across diverse transmission settings in Ethiopia

　　

抗疟药物耐药性的出现威胁着非洲的疟疾控制和消除工作。埃塞俄比亚曾经是减少病例的成功典范，但如今正经历疟疾的再度回升。研究人员在此检测了从埃塞俄比亚15个具有不同传播强度和间日疟原虫混合流行区的地区收集的605个恶性疟原虫分离株的关键耐药基因（Pfmdr1, Pfcrt, Pfk13, Pfdhfr和Pfdhps）以及线粒体基因组。尽管氯喹在很久以前就已停止用于治疗恶性疟原虫，但它仍然是治疗间日疟原虫的首选药物；这种重叠使用可能会在混合流行环境中形成选择压力，从而影响当前恶性疟原虫首选疗法以青蒿琥酯-苯芴醇的耐药标志物。在特定区域，研究人员鉴定出了与苯芴醇敏感性降低相关的优势PfMDR1 NFSND单倍型，同时发现了氯喹耐药PfCRT CVIET单倍型的接近固定。令人担忧的是，与青蒿素部分耐药相关的PfK13变异，即R622I (10%)、A675V (1.7%)和P441L (1.1%)，正在不断扩散。多水平模型表明，R622I与PfCRT CVIET和PfDHFR AICNI存在稳健且独立的关联，而生态学预测因子的关联性较弱且不一致。这些发现突显了在间日疟原虫与恶性疟原虫混合流行环境中Pfcrt和Pfk13突变的遗传共现现象，并可为埃塞俄比亚的抗疟政策提供指导。

疟疾仍撒哈拉以南非洲的主要公共卫生负担，主要致病原为恶性疟原虫。尽管在诊断、媒介控制和以青蒿素为基础的联合疗法方面取得了进展，化疗仍是疟疾预防的基石，但恶性疟原虫在过去70年里对几乎所有抗疟药物都产生了耐药性。青蒿素部分耐药最早在东南亚被发现，如今已在多个非洲国家出现，表现为ACT治疗后寄生虫清除延迟，这与Pfk13基因的β-螺旋桨结构域突变有关。在非洲，青蒿素部分耐药已在卢旺达、乌干达、坦桑尼亚和厄立特里亚被确认。虽然ACTs在非洲仍然广泛有效，但使用最广泛的ACT药物AL治疗后持续出现原虫血症的报告日益增加，引发了对药物效力下降的担忧。埃塞俄比亚于2004年采用AL疗法，曾大幅减少疟疾病例，但近期出现回升，威胁消除目标。潜在促成因素包括气候变化、媒介入侵、Pfhrp2/3基因缺失以及青蒿素部分耐药的出现。特别是PfK13 R622I变异的流行率增加引发了关注。此外，埃塞俄比亚复杂的疟疾生态学特征在于间日疟原虫的混合流行，氯喹仍是治疗该虫种的首选药物。残余的氯喹暴露、误诊和重叠的药物选择压力可能维持了对恶性疟原虫的耐药性选择，从而可能影响ACT的耐受性并塑造独特的耐药谱。为了解这一复杂的动态变化，研究人员开展了全国范围的基因组监测，研究成果发表在《Nature Microbiology》上。该研究为在混合流行环境中追踪恶性疟原虫耐药性及指导治疗政策提供了重要的科学依据。

在关键技术方法方面，研究人员于2019年至2023年间在埃塞俄比亚15个代表不同疟疾传播强度和间日疟原虫混合流行程度的行政区内收集了605份有症状的恶性疟原虫患者样本。研究利用靶向扩增子测序技术对五个恶性疟原虫耐药基因（Pfcrt, Pfmdr1, Pfk13, Pfdhfr, Pfdhps）及线粒体基因组进行了测序分析。此外，研究人员还应用了主成分分析（PCA）、同源相同分析、混合效应逻辑回归和贝叶斯多水平模型等统计与群体遗传学方法，以评估突变共现模式、种群结构及遗传关联性。

在研究结果部分，首先介绍了研究地点特征与参与者人口统计学。埃塞俄比亚15个研究区域的疟疾传播强度差异显著，年寄生虫指数（API）从Fedis的1.0到Salamago的124.0不等，间日疟原虫感染比例介于2.4%至54.0%之间。这种多样化的流行病学特征为调查抗疟药物耐药标志物的分布及其潜在相互作用提供了框架。

其次，关于抗叶酸耐药相关的Pfdhfr和Pfdhps突变的持续性，研究发现尽管磺胺多辛-乙胺嘧啶（SP）在二十多年前就已停用，但耐药相关的突变仍然普遍存在。最常见的PfDHFR单倍型为三重突变体AIRNI和双重突变体AICNI。在Pfdhps基因中，双重突变体ISGEAA占据主导地位。与高水平SP耐药相关的PfDHFR-PfDHPS联合五重单倍型（AIRNI/ISGEAA）常被检测到，而通常罕见的PfDHFR AICNI单倍型也呈现出广泛存在，并与不同的PfDHPS突变体组合，主要分布在近期疟疾回升的西北和西南地区。

第三，氯喹耐药标志物（Pfcrt和Pfmdr1）突变单倍型的流行率仍然很高。分析揭示了与氯喹耐药相关的PfCRT CVIET单倍型占主导地位，在多个特定区域接近甚至达到固定状态，而野生型CVMNK则主要分布在氯喹使用较少的区域。在PfMDR1中，包含Y184F变异的NFSND单倍型高度流行，在所有调查区域均占优势。野生型NYSND单倍型则较少见。研究还发现，传播强度和间日疟原虫的混合流行塑造了氯喹（CQ）和SP耐药标志物的分布，特定单倍型在低传播区和高间日疟原虫混合流行区更为频繁。

第四，与青蒿素耐药相关的Pfk13突变呈现空间聚集性。分析发现了多种与青蒿素部分耐药相关的突变，确证的R622I变异最为流行，尤其在西北部地区高达48.6%；A675V在西部地区观察到；而P441L则主要在中部地区被发现。这些突变表现出强烈的区域异质性。

第五，Pfk13突变体与Pfcrt和Pfmdr1突变存在共现现象。分析揭示了复杂的区域特异性共现模式。为了排除多重感染的影响，研究人员排除了变异等位基因频率在5%至95%之间的样本。Pfk13 R622I变异显著地与多个PfCRT变异和PfMDR1 NFSND共现。分层分析表明，这些共现模式对种群结构高度敏感。混合效应逻辑回归和贝叶斯建模证实，R622I与PfCRT CVIET和PfDHFR AICNI存在稳健且独立的关联，而生态学预测因子的关联性则较弱且不精确。

最后，埃塞俄比亚的恶性疟原虫形成地理和流行病学上截然不同的聚类。结合线粒体序列和分子定义的耐药谱进行的种群遗传分析揭示了两个主要的孤立聚类，这些聚类与地理和间日疟原虫的流行率相一致。与东非和非洲之角其他国家公开可用基因组的比较进一步支持了这一结论，表明观察到的模式反映的是耐药基因上的选择作用，而非底层的种群结构。同源相同分析表明，PfK13的R622I和A675V变异并未形成独特的克隆聚类，而是与野生型分离株共享祖先，暗示它们可能在种群内独立出现；而PfCRT CVIET单倍型则似乎具有与野生型CVMNK不同的祖先起源。

在讨论部分，研究总结指出，该研究提供了对埃塞俄比亚15个地区恶性疟原虫耐药性的全面评估，揭示了由传播强度、物种组成和历史用药塑造的复杂且异质的耐药景观。研究发现了广泛的多重耐药证据，包括高水平的氯喹耐药单倍型PfCRT CVIET和PfMDR1 NFSND，以及与青蒿素部分耐药相关的Pfk13变异的扩散。SP耐药突变的持续存在可能由于目前在HIV护理中广泛使用的甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的选择压力、较低的适应性代价等因素维持。PfCRT CVIET的高流行率反映了在混合流行地区治疗间日疟原虫所带来的持续氯喹压力。Pfk13变异的独立区域涌现表明，当地药物压力和遗传背景在塑造青蒿素部分耐药进化中起着关键作用。如果青蒿素部分耐药进一步扩散，AL的效力可能受损。R622I与PfCRT变异的频繁共现反映了苯芴醇和氯喹重叠的药物压力，而非真正的上位效应。研究强调了在混合流行环境中进行基因组监测的重要性，并建议采取区域特异性的控制策略和前瞻性的抗疟药物多样化 arsenal 以应对不断进化的耐药性。