《Nature Neuroscience》：Hippocampal CA3 connectomics reveals a gradient of mossy fiber inputs and selective feedforward inhibition onto pyramidal cells
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研究人员组装了一个来自小鼠海马CA3的三维电子显微镜体积（约1×1×0.1 mm3）。通过校对和自动分割，研究人员重建并分类了所有含胞体的神经元——包括1,815个锥体细胞和229个抑制性细胞——以及超过55,000个苔藓纤维（mossy fiber, MF）
研究人员组装了一个来自小鼠海马CA3的三维电子显微镜体积（约1×1×0.1 mm3）。通过校对和自动分割，研究人员重建并分类了所有含胞体的神经元——包括1,815个锥体细胞和229个抑制性细胞——以及超过55,000个苔藓纤维（mossy fiber, MF）轴突。锥体细胞沿近端-远端梯度接收更多数量的MF输入。一些远端细胞通过相对较小的终末（含有较少囊泡）表现出惊人的高汇聚性。锥体细胞之间共享的MF输入显著多于通过保度交换（degree-preserving swap）随机化的网络，并且更接近通过保近交换（proximity-preserving swap）随机化的网络。研究人员识别出一个从MF通过胞体周中间神经元选择性靶向锥体细胞亚型的前馈抑制回路基序（feedforward inhibitory circuit motif）。研究人员展示了海马内从回路到细胞类型再到囊泡的多层次大规模映射。该数据集通过Pyr.ai（一个海马连接组学在线平台）共享。
海马CA3连接组学揭示苔藓纤维输入梯度及选择性前馈抑制：一项基于纳米级重建的论文解读
**研究背景与问题**
海马体是情景和空间记忆的关键脑区，其突触可塑性被广泛认为是学习记忆的细胞机制。为探索这一可塑性的结构基础，研究人员曾利用连续电子显微镜（serial electron microscopy, EM）表征海马突触，但受限于体积较小，无法在形态和神经元身份的背景下研究回路连接，因为突触沿轴突和树突分布在毫米级尺度上。尽管在较小模式生物和皮层中，三维EM体积的尺寸已显著增加，但海马体突触分辨率的体积成像和重建仍处于起步阶段。在CA3区域，苔藓纤维（mossy fiber, MF）对锥体细胞的连接被认为参与模式分离（pattern separation）、模式完成（pattern completion）和记忆编码，然而此前缺乏大规模神经元接线图。此外，锥体细胞沿近端-远端轴和浅层-深层轴存在形态和功能异质性，现有研究多基于突触前膨体计数，且假设每个MF膨体仅接触一个锥体细胞，这一假设未在大尺度上得到验证。因此，本研究旨在系统绘制MF-CA3锥体细胞的连接图谱，揭示空间梯度、汇聚性以及细胞类型特异性的抑制回路，为理解海马回路计算功能提供结构基础。该论文发表在《Nature Neuroscience》。
**关键技术与方法**
研究人员从一只4月龄雌性C57BL/6J小鼠的背侧海马获取组织块，经染色后利用X射线显微计算机断层扫描（μCT）定位CA3区域，随后采用GridTape透射电子显微镜（TEM）和束偏转技术采集了0.93×1.03×0.092 mm3的体积（体素大小3×3×45 nm）。通过深度学习（残差对称U-Net）进行自动分割和突触检测，并利用CAVE（Connectome Annotation Versioning Engine）平台进行人工校对。所有含胞体神经元（1,815个锥体细胞和229个抑制性细胞）及超过55,000根MF轴突被重建和分类。MF膨体通过三维网格顶点分类方法提取，囊泡则使用基于深度学习的细胞分割工具Cellpose进行自动识别。网络分析采用配置模型（configuration model）和半径模型（radius model）进行随机化比较。
**研究结果**
**数据集概述（Dataset overview）**
研究人员通过μCT与EM图像的配准，确认了体积位于CA3区域，并注册到艾伦小鼠脑通用坐标框架（CCFv3）。自动分割质量评估显示，锥体细胞轴突平均每108 μm出现一次分割错误，MF轴突为167 μm，人工校对效率为11.3 mm/h。重建的神经元包括1,815个锥体细胞和229个抑制性细胞，以及超过55,000根MF轴突。核大小分布显示锥体细胞核比抑制性神经元大，且突触大小过滤表明最大突触位于透明层（stratum lucidum）。
**MF输入到CA3锥体细胞的映射（Mapping MF inputs to CA3 pyramidal cells）**
研究人员选择636个“长顶端锥体细胞”（long apical pyramidal cells），映射了约25,200根MF轴突的输入。MF输入呈双峰分布：24%的细胞接收极少或零输入（稀疏棘细胞，sparsely thorny cells），其余细胞接收15个以上输入（多棘细胞，thorny cells），其中2%的细胞接收超过100个输入，最高接近300个。稀疏棘细胞优先位于深层和远端区域，核较小，树突分支较少；多棘细胞则位于浅层。
**远端CA3锥体细胞比近端接收更多MF输入（Distal CA3 pyramidal cells receive more numerous MF inputs than proximal cells）**
沿近端-远端轴，锥体细胞接收的MF输入数量呈梯度增加（Mann-Whitney U检验，p=1.7×10??）。具有最多输入的细胞集中在浅层和远端区域。
**远端锥体细胞中MF输入共享增加（Increased sharing of MF inputs in distal pyramidal cells）**
与配置模型相比，重建网络中的锥体细胞对共享更多MF输入，且聚类系数更高。与半径模型（10 μm或50 μm）比较后，这种共享增加可被空间邻近性解释。远端锥体细胞输入共享增加，但参与比（participation ratio）降低，表明输入数量驱动了表征维度的降低，而非共享本身。
**高汇聚锥体细胞通过相对较小的MF终末接收输入（High-convergent pyramidal cells receive inputs through relatively small MF terminals）**
研究人员分割了24,264个MF膨体（占85%以上），其体积分布广泛（数μm3至40 μm3以上）。膨体体积与囊泡数量高度相关。同一MF轴突的膨体间体积不相关。高汇聚细胞（>111个MF输入）接收的膨体平均体积较小，呈负相关（Pearson r=-0.525, p=3.09×10?2?），且远端细胞通过更小的膨体和更少的活性区接收输入，与电生理记录的突触强度梯度一致。
**锥体细胞的细胞类型特异性前馈抑制（Cell-type-specific feedforward inhibition to pyramidal cells）**
研究人员分析抑制性轴突的输出突触，发现许多抑制性细胞优先靶向多棘细胞或稀疏棘细胞。通过沿骨架测量突触到胞体的距离，区分出胞体周靶向和树突靶向抑制性轴突。大多数选择性抑制性轴突为胞体周型，其轴突主支有髓鞘，且轴突投射区域分别对应锥体细胞层的浅层和深层。MF轴突通过丝状伪足和小膨体选择性支配靶向多棘细胞的中间神经元，形成MF-中间神经元-锥体细胞的前馈抑制回路基序。
**总结与讨论**
本研究强调了CA3区域锥体细胞兴奋性和抑制性输入的组织原则：MF输入沿近端-远端轴呈梯度分布，远端高汇聚细胞通过较小膨体整合更多输入；多棘和稀疏棘细胞分别由不同抑制性轴突靶向，且MF选择性驱动靶向多棘细胞的中间神经元。这些发现支持了CA3中模式分离（近端）和模式完成（远端）的梯度模型，并提示前馈抑制通过调控动作电位时间精度促进稀疏放电。数据集通过Pyr.ai平台公开共享。
**研究结论翻译**
在本研究中，研究人员展示了一个来自海马CA3区域的重建体积（约1×1×0.1 mm），由GridTape技术收集的2,048张连续TEM切片生成。CA3中的锥体细胞分为两个亚层：多棘细胞和稀疏棘细胞，深层稀疏棘细胞具有更少的棘状突和更小的核。研究人员发现MF输入到多棘细胞的近端-远端梯度：近端神经元接收稀疏但大的MF膨体，而远端神经元接收更密集但小的MF膨体，且远端区域输入共享增加。抑制性输入也具有分离性，多棘细胞和稀疏棘细胞分别由不同的抑制性轴突靶向。最后，MF轴突选择性支配支配多棘细胞的中间神经元。总体而言，本研究表征了CA3中锥体细胞兴奋性和抑制性输入的组织结构。
