神经性B族维生素、维生素D3和α-硫辛酸在体外神经退行性变模型中的作用

《Nutrients》：The Effects of Neurotropic B Vitamins, Vitamin D3, and Alpha-Lipoic Acid in In Vitro Models of Neurodegeneration

　　

背景：周围神经病（Peripheral Neuropathy, PN）是最常见的外周神经系统疾病之一，影响约10%的普通成年人群，导致疼痛、感觉异常和感觉丧失，负面影响患者生活质量。该病以周围神经损伤为特征，常与风险因素相关，其中糖尿病是最常见原因。过去三十年间，PN患者发病率显著增加，但目前尚无逆转或预防PN发展的药物疗法。因此，神经性B族维生素（特别是维生素B₁、B₆和B₁₂）——这些对保护神经免受损伤、神经再生和维持神经健康至关重要的物质——成为有前景的治疗选择。其他具有治疗潜力的生物因子包括维生素D₃（已被描述为神经可塑性和神经炎症的调节因子，有促进损伤后神经元再生的迹象）以及α-硫辛酸（Alpha-Lipoic Acid, ALA，一种在PN中已被充分描述的治疗选择）。方法：研究人员通过过氧化氢（H₂O₂）或同型半胱氨酸诱导的体外神经突退化，测定了维生素B₁、B₆、B₁₂、D₃和ALA的再生能力。结果：与先前研究一致，结果表明，维生素B₁、B₆和B₁₂的组合在同型半胱氨酸诱导的退化后对神经突延伸具有显著更好的效果。在H₂O₂损伤的神经细胞中，三种神经性B族维生素的组合也显示出优于单独B族维生素治疗的效果，表现为损伤后更长的神经突长度。维生素D₃在健康及受损神经细胞中也显示出对神经突的神经再生效应，而ALA似乎仅提供保护作用，防止持续损伤并支持健康细胞中的神经突生长。任何治疗组合均未观察到协同效应。结论：研究人员建立了一个同型半胱氨酸诱导退化的体外模型，并利用该模型与H₂O₂诱导退化模型，提供了维生素B₁、B₆、B₁₂和D₃具有神经突再生能力的证据。

**论文解读：神经性B族维生素、维生素D₃与α-硫辛酸在体外神经退行性变模型中的作用**

**研究背景与问题**
周围神经病（Peripheral Neuropathy, PN）是影响约10%成年人群的常见外周神经系统疾病，表现为疼痛、感觉异常和感觉丧失，严重降低患者生活质量。PN的病理机制涉及轴突变性、脱髓鞘、离子通道失调、中枢敏化和神经炎症，而糖尿病是其最常见病因，约50%的2型糖尿病患者在病程中会出现糖尿病性周围神经病（Diabetic Peripheral Neuropathy, DPN）。尽管DPN的发病机制复杂，涉及代谢、血管和遗传因素，但高血糖及由此引发的氧化应激（通过晚期糖基化终末产物增强）是核心驱动因素。目前尚无逆转或预防PN的药物，因此需要探索新的治疗策略。神经性B族维生素（B₁、B₆、B₁₂）对神经保护、再生和维持健康至关重要；维生素D₃作为神经可塑性和神经炎症的调节因子，有促进损伤后神经元再生的潜力；α-硫辛酸（Alpha-Lipoic Acid, ALA）作为抗氧化剂，已在临床中用于治疗DPN。然而，这些物质在神经再生中的具体机制及联合效应尚不清楚。本研究旨在利用体外神经退行性变模型，评估维生素B₁、B₆、B₁₂、D₃和ALA的神经再生或保护能力，并探索其协同效应。论文发表在《Nutrients》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术：
1. **细胞培养与模型建立**：使用NG108-15神经细胞株（小鼠神经母细胞瘤与大鼠胶质瘤杂交细胞）和SCL4.1/F7雪旺细胞株（永生化大鼠雪旺细胞），分别进行单层培养和三维胶原共培养（含80% v/v I型大鼠尾胶原、10% v/v MEM、5.8% v/v NaOH及雪旺细胞悬液，整合有固定网格）。
2. **神经退行性变诱导**：用10 μM过氧化氢（H₂O₂）处理2小时，或150 μM同型半胱氨酸处理24小时，诱导神经突退化。
3. **药物处理与筛选**：在无B族维生素的培养基中，单独或联合添加维生素B₁（40 μM）、B₆（20 μM）、B₁₂（0.4 μM）、维生素D₃（0.001–10,000 nM）和ALA（0.1–100 μM）。
4. **形态学与功能分析**：使用Incucyte S3活细胞成像系统实时监测神经突生长和细胞数量，通过免疫荧光染色（抗βIII-Tubulin）和Neu
ronJ插件量化神经突长度，乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放实验评估细胞毒性。

**研究结果**

**3.1 未损伤单层NG108-15细胞经B族维生素处理**
与无B族维生素对照相比，单独或联合使用维生素B₁、B₆、B₁₂均增加神经突长度，其中联合治疗组效果最显著（增加95.63% ± 25.50%），且优于单独B₁（33.96%）、B₆（14.27%）和B₁₂（60.59%），显示出协同效应。

**3.2 损伤单层NG108-15细胞经B族维生素处理**
H₂O₂损伤后，单独B族维生素处理组细胞数显著减少，而B₁、B₆、B₁₂联合组细胞数减少不显著（-23.57%），表明联合治疗具有细胞保护作用。

**3.3 损伤单层SCL4.1/F7雪旺细胞经B族维生素处理**
H₂O₂损伤后，所有处理组雪旺细胞数均显著减少，但B₁、B₆、B₁₂联合组细胞数最高，提示对雪旺细胞有一定保护作用（未达显著）。

**3.4 LDH细胞毒性实验**
H₂O₂损伤后，实验组吸光度与未损伤组无显著差异，表明B族维生素在20 μM B₆及以下浓度无细胞毒性；但200 μM B₆显著增加LDH释放，提示高浓度B₆有轻微毒性。

**3.5 维生素D₃和ALA对健康NG108-15细胞的影响**
剂量反应显示，维生素D₃在1 nM和10 nM时显著增加神经突长度（分别增加27.82%和37.60%），更高浓度（1000–10,000 nM）导致细胞死亡。ALA在0.5 μM、1 μM和10 μM时显著增加神经突长度（分别增加23.37%、23.36%和15.81%），更高浓度无益。

**3.6 维生素D₃和B族维生素对健康NG108-15和SCL4.1/F7细胞的影响**
在单层培养中，10 nM维生素D₃与B族维生素联合使用显著增加神经突长度（153.72 μm），但无协同效应（维生素D₃单独处理为152.52 μm）。在三维共培养中，维生素D₃单独处理使神经突长度增加50.58%，联合处理增加45.68%，仍无协同效应。

**3.7 同型半胱氨酸诱导的神经退行性变**
同型半胱氨酸浓度≥150 μM时显著降低神经突长度，50 μM即显著减少神经突数量。150 μM被选为最优浓度，因其诱导退化而不引起显著细胞死亡。

**3.8 维生素和ALA对同型半胱氨酸损伤单层NG108-15细胞的再生效应**
B族维生素组合显著增加神经突长度（69.11%）。维生素D₃在0.01–10 nM范围内均显著增加神经突长度，且无剂量依赖性。ALA（1或10 μM）无显著再生效应。

**3.9 维生素和ALA对H₂O₂损伤单层NG108-15细胞的再生效应**
维生素D₃（10 nM）使神经突长度增加25.21%，与B族维生素联合无协同效应。ALA（1或10 μM）无显著再生效应，100 μM时增加17.40%但未达显著。ALA与B族维生素联合无任何组合显示显著效果。

**讨论与结论**
讨论部分指出，H₂O₂诱导的氧化应激是PN病理核心，而B族维生素组合通过支持细胞代谢恢复神经突，联合治疗具有细胞保护作用。维生素D₃通过基因组模式（如诱导神经生长因子表达）促进神经突生长，但未与B族维生素产生协同效应，可能因两者作用通路独立。同型半胱氨酸诱导退化模型模拟了高同型半胱氨酸血症相关PN，该模型显示B族维生素组合和维生素D₃有效促进再生，而ALA仅具保护作用（在健康细胞中促进神经突生长，但在损伤细胞中无再生效果）。ALA与B族维生素联合未显示协同，可能因分子间相互作用（如氧化还原反应或形成复合物）。

**结论翻译**：总之，本研究中开发和利用的模型整合了神经退行性变的关键特征，突出了其对于研究周围神经病潜在治疗候选分子作用机制的相关性。除了越来越多的证据表明维生素B₁、B₆和B₁₂组合在体外对神经突生长和再生具有优越效果外，研究人员还证明了维生素D₃在同型半胱氨酸和过氧化氢诱导的神经退行性变模型中具有促进神经突延伸的神经再生效应。另一方面，ALA未显示出神经再生效应，但显示出潜在神经保护效应，因为它增加了健康单层NG108-15细胞中的神经突长度。此外，研究人员发现，维生素D₃或ALA与神经性B族维生素的组合在本模型中未显示出协同效应。总之，这些发现表明，联合使用神经性B族维生素和维生素D₃通过不同机制促进神经突再生，而ALA似乎发挥神经保护而非再生作用。此外，新建立的同型半胱氨酸诱导退化模型为研究针对周围神经病的治疗策略提供了额外的体外平台。