《Biomolecules》：Current Techniques for Inorganic Polyphosphate Detection and Characterisation
聚磷酸盐（polyP）是一种进化上保守的正磷酸盐残基线性聚合物，在从细菌到哺乳动物的生物体中具有多种功能。除了在磷酸盐和能量储存中的作用外，聚磷酸盐还与血栓形成、炎症、癌症、代谢、细胞骨架调节和神经退行性疾病有关。聚磷酸盐还作为分子支架与富含赖氨酸的蛋白质相互作用，并可能参与蛋白质折叠和淀粉样蛋白形成。然而，生物化学异质性，包括链长、亚细胞定位和超分子组织的变化，以及缺乏明确确定的哺乳动物生物合成途径，限制了对聚磷酸盐生物学的机制理解。可靠的检测和定量仍然具有挑战性，因为当前方法通常存在特异性有限、链长偏差、定量稳健性不足以及来自其他高度阴离子生物分子（如DNA或RNA）的干扰。本综述总结了当前用于聚磷酸盐检测和表征的方法学。新兴的聚磷酸盐特异性探针，包括来源于多磷酸酶的重组聚磷酸盐结合结构域和保守的组氨酸α-螺旋结构域，可能改善复杂生物系统中聚磷酸盐的定性和定量分析。改进的分析策略对于定义聚磷酸盐的生理作用并评估其作为生物标志物和治疗靶点的潜力至关重要。
1. 引言
聚磷酸盐（polyP）是一种进化上保守的正磷酸盐（Pi）残基线性聚合物，通过高能磷酸酐键连接。虽然在微生物中作为能量和磷酸盐储存的特征已明确，但在哺乳动物系统中的精确生化合成、分布和代谢仍知之甚少。这一知识空白源于缺乏细菌多磷酸激酶（PPK）或酵母液泡转运蛋白伴侣4（VTC4）复合物的哺乳动物同源物（这些复合物作为跨膜聚合酶生成polyP），以及缺乏明确的胞外多磷酸酶（PPX），这使得细胞内polyP的遗传操作和定量分析复杂化。尽管线粒体、肌醇磷酸代谢和非特异性磷酸酶与polyP动力学相关，但缺乏特异性polyP代谢酶阻碍了细胞内polyP的选择性操作以及哺乳动物细胞和组织中标准化分析方法的建立。
在生化上，polyP在链长、细胞定位和分子相互作用方面高度异质性。polyP链长从几个残基到数千个残基不等，取决于生物体和细胞环境。例如，哺乳动物血小板分泌中等链长聚合物（80–100个残基），但细胞内主要含有长链聚合物（>300个Pi残基），这些聚合物在激活时暴露于质膜。由于其主链高度带负电，polyP优先与阳离子和蛋白质发生静电相互作用，充当蛋白质稳定伴侣。polyP也在核仁中积累。polyP是否通过多酸性、丝氨酸和富含赖氨酸结构域（PASK）共价修饰蛋白质，或严格通过非共价离子相互作用，仍存在积极争论。
polyP已在多种哺乳动物组织和亚细胞区室中检测到，包括血小板，其功能远超经典的能源和磷酸盐储存库。在血栓形成中，血小板来源的polyP已成为驱动血栓传播和触发炎症的重要介质。polyP在体内激活因子XII，触发血栓炎症性血浆接触系统。在体外，polyP还加速凝血酶生成，调节纤维蛋白凝块结构，并影响纤维蛋白溶解。polyP还与内皮细胞中的炎症信号传导相关，其中细胞外polyP通过P2Y1受体和晚期糖基化终末产物受体（RAGE）激活促炎途径。
除了血栓炎症，polyP越来越多地与多种细胞和病理过程相关，如肥大细胞生物学和肿瘤相关炎症。在结直肠癌中，在表达CD68的肿瘤相关肥大细胞亚群中检测到细胞内polyP。总体而言，这些发现引起了人们对polyP作为癌症和血栓炎症性疾病潜在生物标志物和治疗靶点的极大兴趣。
此外，polyP通过富含赖氨酸结构域的蛋白质相互作用充当分子支架。最近一项在大肠杆菌中表达的重组人类蛋白质大规模筛选表明，这些富含赖氨酸的区域经常表现出polyP依赖的电泳迁移率变化。这在核蛋白和RNA结合蛋白中尤为明显，其中polyP与核糖体RNA转录和RNA聚合酶I活性的调节相关，提示其在转录控制和染色质组织中具有更广泛的作用。在细胞核之外，polyP参与调节肌动蛋白细胞骨架动力学和肌动球蛋白活性的ATP依赖性过程。此外，体外研究表明，polyP作为未折叠蛋白质的分子伴侣，促进稳定的β-折叠富集构象，并调节淀粉样蛋白生成过程中的寡聚中间体。这些观察结果将polyP置于少数能调节淀粉样蛋白形成和tau蛋白聚集的内源性分子之中，使其与神经退行性疾病紧密相关。
polyP在血栓形成、炎症、癌症、代谢和神经退行性疾病中日益增长的兴趣凸显了对能够准确检测和表征生物系统中该聚合物的稳健分析平台的需求。改进的分析和诊断方法对于定义polyP的生理作用、理解其特定功能以及评估其临床潜力至关重要。尽管兴趣日益增长，但我们对polyP生物学的理解仍不完整，且受到方法学限制。为此，本综述整合了当前关于polyP检测技术的知识，重点介绍了新兴方法。在此，研究人员批判性地比较了当前用于polyP定位、定量和结构表征的方法，重点关注检测特异性、链长偏差、生物基质干扰以及必要的验证对照。
2. 用于polyP检测的荧光染料
2.1. 经典异染性染料
2.1.1. DAPI和甲苯胺蓝
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）是最广泛用于polyP检测的化学探针之一，涵盖原位空间成像和凝胶分析。在荧光显微镜中，DAPI与固定细胞和活细胞成像高度兼容，可定位polyP富集细胞器内密集堆积的细胞内polyP聚集体。除了显微镜，DAPI还是琼脂糖或尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后polyP大小测定的关键染色剂。在这些方法中，polyP不以离散条带形式分离，而是以反映内源性长度多分散性的异质涂抹条带形式呈现；这些迁移图谱通过DNA或合成polyP梯状条带校准以估算表观链长。
DAPI与polyP结合后，其特征荧光发射从蓝色（450–475 nm）转变为黄绿色荧光（520–550 nm），正是这种位移（而非简单的强度增加）被用于诊断性地将polyP与其他细胞成分区分开。然而，DAPI对短链polyP的灵敏度有限，无法可靠检测低于约15个磷酸残基的聚合物。DAPI还与核酸（DNA和RNA）具有高亲和力结合，尤其在线粒体和细胞核中，或含有细胞外核酸的样本中。由于DAPI荧光可能受核酸和其他富磷酸盐代谢物影响，DAPI信号应仅结合酶降解、提取对照和正交检测方法进行解读。
甲苯胺蓝O（TBO）是一种经典的异染性染料，用于电泳应用中的polyP检测。与polyP结合后，TBO表现出异染性位移，可在约530 nm处可视化凝胶中的polyP物种，产生紫色/红色。虽然DAPI在检测短链polyP方面相对较弱，但TBO在凝胶基质中解析短至中等链长polyP物种方面表现良好。TBO与细胞内多阴离子、核酸（包括DNA和RNA）以及硫酸化糖胺聚糖存在交叉反应。尽管如此，DAPI和TBO仍是检测polyP的核心实验室方法。DAPI适用于凝胶筛选，但不应作为富含核酸样本中独立的polyP特异性探针使用。
2.1.2. 其他polyP染料
几种替代经典染料已被探索用于polyP或无机磷衍生物定位，但通常分析物选择性较低。吖啶橙（AO）是一种异染性染料，可与富磷酸盐结构结合，但由于与单链和双链核酸的强嵌入和静电相互作用，对polyP的特异性较差。因此，其polyP应用仅限于核酸背景可控或不在同一区室中的特定环境，例如DAPI和吖啶橙共染色已用于定位海胆卵中的颗粒内polyP。在另一种应用中，AO通过测量染料摄取间接追踪锥虫布鲁斯前循环锥虫和杜氏利什曼原虫前鞭毛体中的无机焦磷酸盐周转。甲基绿-钼酸铵不直接染色polyP，而是设计用于与聚合物酶水解后释放的正磷酸盐降解产物反应。结合polyP降解酶，产生的还原型磷钼酸盐复合物可染色定位的降解产物，从而通过PAGE追踪和可视化解析的polyP条带。尼罗红主要用作细胞内脂滴和微塑料检测的亲脂性染料，仅在环境磷酸盐研究中找到小众应用，用于评估营养胁迫下的脂质-polyP代谢转变，而非直接检测polyP。
2.2. 新一代合成荧光团：JC-D7和JC-D8
与DAPI或TBO相比，新型荧光探针JC-D7和JC-D8代表了重要里程碑，它们对polyP具有更高的选择性，并由于核酸干扰减少而能够在活细胞和复杂组织架构中进行定位。这些苯并咪唑鎓衍生染料是通过筛选最初针对高电荷多阴离子（如肝素和三磷酸鸟苷（GTP））的组合化学文库发现的。先前工作验证了JC-D7/JC-D8的选择性，证明在初级神经元和星形胶质细胞培养物、果蝇脑组织以及帕金森病细胞模型中，通过荧光显微镜可高对比度可视化细胞内含polyP结构。此外，JC-D7已成功定位衣藻酸钙体以及固定和活体植物及藻类细胞内的致密polyP颗粒，支持其用于检测长链polyP储存。然而，尽管JC-D7和JC-D8具有选择性优势，但必须仔细优化具体实验方案，因为染料性能和加载动力学可能因实验条件和细胞微环境而异。
2.3. 比较和间接染色策略：SYTOX染料
花青素核酸染料，特别是SYTOX Green和SYTOX Orange，越来越多地被整合到polyP工作流程中用于间接或比较分析。SYTOX染料不应被视为直接polyP探针；其价值主要在于排除或共定位策略，有助于区分细胞外核酸与推定的polyP富集结构。由于SYTOX染料净带正电荷且膜不可渗透，传统上用于标记细胞外DNA或评估细胞过程（如中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成、细菌死亡、凋亡和坏死）中的膜完整性。SYTOX染料作为有用核酸标记物的相同特征，以不同形式重新引入了交叉反应问题。SYTOX染料也与细胞外polyP（如活化血小板分泌的聚合物）发生交叉反应，因为polyP链上规则间隔的负电荷模拟了DNA糖-磷酸骨架的静电和空间拓扑结构。为从背景核酸中分离出polyP特异性信号，研究人员可通过结合DAPI、排除染料（SYTOX）以及区室或蛋白质特异性免疫荧光标记在同一样本中实现空间定位。该工作表明，通过DAPI、SYTOX Orange和抗CD6共染色，利用所有三种信号的收敛来识别真正的polyP富集区域，可定位脱颗粒后血小板表面暴露的polyP，而非依赖单一染料。
3. 基于蛋白质的polyP探针
3.1. 催化失活或截短的PPX衍生结合探针
重组polyP探针的开发标志着分析精度的重大进展，将该领域从非特异性化学染料转向基于蛋白质的检测工具。大肠杆菌PPX酶是一种二聚体，由两个具有酶活性并水解polyP的N端结构域和两个介导底物结合的C端结构域组成。PPX缺失突变体PPX_Δ12缺少结构域1和2，但保留polyP结合位点。PPX_Δ12也称为多磷酸结合结构域（PPBD），特异性识别并结合长度超过35个磷酸残基的polyP链。该方法的早期验证在酿酒酵母中展示，抗体标记的PPX_Δ12定位了内源性长链polyP库。后续研究将PPX_Δ12方法学扩展到多种真核系统（包括克氏锥虫、布氏锥虫和果蝇）中的细胞内polyP颗粒定位。为专门绘制人类细胞器动力学，一项特殊方案采用了携带Xpress表位标签（八氨基酸序列DLYDDDDK）的PPX_Δ12探针，在SH-SY5Y、HeLa、A549和HEK293细胞系中实现了高对比度核免疫定位和定量。PPX_Δ12对核酸和其他多阴离子（如高分子量右旋糖酐硫酸酯、糖胺聚糖、DNA、RNA和过度硫酸化软骨素）的干扰有限，这些正是限制上述染料的一类干扰物。先前研究制备了荧光标记的PPX_Δ12探针，共价偶联到胺反应性Alexa488。PPX_Δ12-Alexa488探针随后应用于流式细胞术，定量人血浆样本中的血小板相关polyP。相比之下，使用低分子量染料（如DAPI和JC-D7）结合polyP的流式细胞术可分析大细胞群体并动态监测polyP相关反应。与经典异染性染料（如DAPI或甲苯胺蓝）相比，基于重组PPX_Δ12/PPBD的探针对长链polyP具有更高的特异性。因此，重组polyP探针在荧光抗体标记后可提供强大且可靠的聚合物可视化和定量工具。
3.2. 保守组氨酸α-螺旋结构域（CHAD）蛋白
含CHAD的蛋白质代表第二类结构上不同的polyP结合蛋白，用于检测。CHAD结构域与polyP颗粒形成稳定相互作用，这些结构域被认为是高选择性polyP识别模块。在结构上，CHAD蛋白通常包含一个介导polyP结合的C端CHAD结构域，以及在某些蛋白质中与核苷酸和磷酸盐代谢相关的N端CYTH结构域。与PPX衍生的PPX_Δ12/PPBD不同，CHAD结构域由保守的α-螺旋束组成，形成带正电的表面和孔道，与带负电的polyP链发生静电相互作用。大肠杆菌ygiF多磷酸酶（一种三磷酸隧道金属酶）利用其CHAD结构域通过N端（C-LHTSAR）和C端（LHSGKR）的相似短序列识别polyP，表明最小保守序列基序（而非整个结构域折叠）可能足以识别polyP。生化研究表明，来自不同进化谱系（如细菌、古菌、真核生物）的CHAD结构域表现出不同的polyP结合动力学和亲和力；例如，某些CHAD蛋白表现出简单的一对一结合行为，而其他则表现出多种亲和力。荧光标记的CHAD构建体，包括来源于硫磺矿硫化叶菌或大肠杆菌蛋白的GFP标记探针，已成功用于polyP定位。CHAD探针具有高亲和力和选择性polyP结合，且与活细胞成像兼容。重组polyP结合探针，如CHAD和PPX_Δ12/PPBD，代表了经典染料检测方法的有前途的替代方案，可能改善复杂生物系统中polyP的活细胞成像和定量分析。
4. 用于polyP定量的显色分析和荧光底物
这些分析不直接测量polyP。它们量化水解后释放的正磷酸盐，因此需要对预先存在的Pi、不完全水解、样本基质效应和提取回收率进行严格校正。
4.1. 磷钼酸盐分析
polyP可通过化学或酶水解生成Pi，随后在酸性条件下与钼酸盐反应形成磷钼酸盐复合物来定量。尽管分光光度法和荧光法定量polyP分析共享这一基本化学原理，但在下游光学检测策略上有所不同。
4.1.1. 孔雀绿分析
孔雀绿分析是一种广泛使用的比色法，用于检测和定量正磷酸盐，因其简单、成本低和高分析灵敏度。其机制依赖于酸性条件下的两步反应。首先，正磷酸盐与钼酸盐反应形成黄色磷钼酸盐复合物。该复合物不经化学还原，而是直接与三苯甲烷染料（孔雀绿染料）结合，产生绿色复合物。该颜色强度在620–660 nm处用分光光度法测量，吸光度与样本中的正磷酸盐浓度成正比。反映复合物形成的颜色发展通常需要10至30分钟，商业试剂在室温下通常至少稳定24小时，便于快速高通量测量。由于孔雀绿试剂与游离正磷酸盐反应，polyP必须在分析前进行水解以释放可测量的单体磷酸盐残基。随后通过将吸光度值与已知磷酸盐浓度生成的标准曲线相关联来确定polyP浓度。因此，孔雀绿分析定量了水解后从polyP释放的总磷酸盐，但对天然聚合物链长和分子量分布不敏感。此外，该分析易受多种干扰。砷酸盐作为磷酸盐的结构类似物，形成类似复合物，加速颜色发展并导致假阳性结果。
4.1.2. 钼蓝分析
钼蓝分析是一种经典的正磷酸盐定量比色法，依赖于两步反应过程。反应始于正磷酸盐与钼酸铵在酸性条件下相互作用，生成无色磷钼酸盐复合物。该复合物随后被还原剂（通常为抗坏血酸或氯化亚锡，两者均需每日新鲜配制）还原，生成稳定且呈深蓝色的化合物，称为磷钼蓝。在700–890 nm范围内监测该蓝色复合物的吸光度，信号强度与正磷酸盐浓度成正比。类似孔雀绿分析，钼蓝试剂无法直接检测polyP，需进行初步酸或酶水解。因此，polyP含量通常通过从水解后测得的总磷酸盐中减去基线游离正磷酸盐水平来间接定量。虽然该分析成本低廉、稳健且易于实施，颜色发展约需15至30分钟，但其灵敏度低于孔雀绿方法。钼蓝方法的主要限制在于其对化学干扰的敏感性。砷酸盐、硅酸盐和有机膦酸盐在此分析条件下表现出与正磷酸盐相似的化学行为，形成类似颜色的复合物，导致假阳性反应和高估真实磷酸盐含量。最终，用于polyP定量的钼蓝与孔雀绿分析之间的选择主要取决于具体应用和样本类型。
4.2. 末端标记和功能化
为实时监测polyP结合、水解和磷酸酶活性，并识别polyP相互作用伙伴，近期的进展已转向开发共价修饰的末端标记polyP衍生物，作为荧光底物。两种主要合成策略是合成末端酚酯和创建氨基磷酸酯连接。通过将4-硝基苯酚或4-甲基伞形酮通过EDAC介导的磷酸酯键偶联到polyP末端磷酸盐，生成了显色和荧光polyP底物；双端标记底物用于两步分析，其中内切多磷酸酶切割暴露新末端，供外切多磷酸酶驱动染料释放，从而将Nudt2鉴定为内切多磷酸酶。此外，针对末端单磷酸盐的化学功能化允许在不改变内部多阴离子主链相互作用的情况下合成polyP探针。先前工作利用EDAC介导的碳二亚胺化学（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亚胺）将伯胺、荧光团或生物素标签偶联到polyP的末端单磷酸盐残基。虽然这种方法促进了polyP的固定或追踪而不破坏其多阴离子相互作用，但这些末端标记荧光底物的应用仍具挑战性，原因在于技术要求高的合成、可变的标记效率以及对polyP链长的依赖性。
5. 用于polyP结构测定的先进生物物理技术
5.1.
31P核磁共振（
31P NMR）波谱学
31P核磁共振（
31P NMR）波谱学是一种强大的非破坏性生物物理工具，用于解析生物样本中polyP的结构特征、链长和区室特异性磷酸代谢谱。基于化学不等价磷原子之间的化学位移差异，
31P NMR可区分正磷酸盐、焦磷酸盐和polyP聚合物。该方法的主要优势在于其能够在复杂系统内进行体内和区室特异性测量，从而被广泛用于研究多种生物模型中的polyP动力学，包括藻类、珊瑚组织、哺乳动物细胞系和人血小板。值得注意的是，在人血小板中，
31P NMR结构研究确定，分泌的polyP以上清液中相对较短的链形式存在，平均60–80个磷酸残基，与血小板细胞内和微生物系统中的长链聚合物（超过数百个残基）形成对比。尽管具有分析能力，标准溶液态
31P NMR无法检测密集堆积于不溶性酸钙体、高度浓缩或以其他方式固定在颗粒内的polyP，因为这些微环境中的受限分子运动导致严重的偶极相互作用和峰展宽。此外，由于从生物组织中提取的polyP样本固有地具有多分散性，计算出的链长通常反映的是异质混合物的集体平均性质，而非识别离散的单个聚合物群体。最后，
31P核固有的低旋磁比导致质量灵敏度低，需要高样本浓度、长时间采集以及专用高场仪器，限制了其在常规临床诊断中的实用性。
5.2. 色谱法
补充磁共振，色谱技术代表基于分子大小和净负电荷性质分离polyP物种的稳健方法。高效液相色谱（HPLC）变体，主要是阴离子交换色谱和尺寸排阻色谱，为解析复杂含磷酸盐混合物和绘制polyP链长分布提供了高分析分辨率。然而，这些方法在分析前需要破坏性的多步提取和纯化方案，因此严格限于体外生化应用，而非体内或原位追踪。此外，高度异质、多分散的生物polyP库的分析仍具技术挑战，原因在于有限的质量灵敏度、要求苛刻的样本制备以及解析高电荷长链聚合物时的固定相相互作用假象。
5.3. 质谱法
基于质谱（MS）的方法也越来越多地被用于polyP分析；然而，必须明确区分聚合物本身的直接分析与其细胞相互作用组的表征。完整polyP分子的直接质谱分析仍是一项技术挑战，因为其高度多阴离子和化学多分散性的主链在标准软电离过程（如电喷雾电离（ESI））中易发生严重的源内裂解、热降解和不可预测的碎片化。因此，针对该分析物的结构和定量MS策略通常依赖于间接工作流程，如酶预消化为均匀单体、末端化学衍生化或总磷酸盐评估。尽管如此，也已开发出专门的ESI-MS方案来直接表征和定量无机polyP。除了直接聚合物分析，质谱还提供了对polyP-蛋白质动力学的重要见解；虽然共价蛋白质多磷酸化和焦磷酸化在机制上仍有争议并需要验证，但LC-MS/MS磷酸化蛋白质组学的最新进展已能够检测人类蛋白质中的内源性焦磷酸化位点，而无机磷酸盐检测方法如离子色谱-电感耦合等离子体质谱（IC-ICP-MS）则提供了定量游离磷酸盐物种的基线技术。
5.4. 拉曼和红外振动光谱
最后，拉曼光谱和傅里叶变换红外（FTIR）光谱已成为基于特征磷酸盐振动信号进行polyP表征的强大互补生物物理技术，提供空间信息同时避免荧光染色假象。基于拉曼的显微光谱学因其高空间分辨率而特别有利，可在细胞内微区室（如酸钙体或微生物颗粒）内以非破坏性方式原位可视化浓缩的polyP。然而，polyP检测仍具挑战性，原因在于低基线灵敏度和与其他含磷酸盐化合物的显著光谱重叠。
6. 分析策略总结
总体而言，先进的生物物理和分析技术显著增强了我们检测和表征polyP的能力。然而，由于没有单一方法能克服所有分析挑战，结合不同互补方法对于获得可靠结果至关重要。图1和表5展示了一个概念性工作流程指南（而非严格的特异性或性能分类）用于方法选择。该分类系统基于每种方法与polyP相互作用的方式，组织成同心、多层级的旭日图层次结构。内环将分析工具包分为蛋白质基探针、定位、结构测定和定量。中环将这些方法映射到其精确的生理和结构应用，包括平均链信息和磷酸代谢谱、短至中链polyP、链长和分子量、活细胞成像以及总正磷酸盐产量。外环显示了可用于检测polyP的具体可操作技术（例如，孔雀绿、钼蓝、
31P核磁共振（
31P NMR）波谱学、琼脂糖或尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）-甲苯胺蓝、阴离子交换高效液相色谱（HPLC）、LC/MS-MS（液相色谱-串联质谱）、JC-D7/JC-D8、多磷酸结合结构域（PPX_Δ12/PPBD）、保守组氨酸α-螺旋结构域（CHAD））。
7. 结论与未来展望
polyP通过与蛋白质、阳离子、核酸和其他细胞结构的静电相互作用调节多种生物过程。然而，其分析仍具挑战性，因为polyP化学上异质、依赖于链长、高度阴离子且常与复杂生物基质相关。目前没有一种方法能提供关于丰度、链长、定位和分子组织的完整信息。因此，可靠的polyP分析需要正交工作流程，结合选择性探针、酶对照、定量磷酸盐测量和结构方法。未来进展将依赖于改进的重组探针、标准化提取和回收方案，以及在生理条件下区分polyP与其他多阴离子生物分子的活细胞兼容方法。
