反相反正切-反余切（AAA）探针：一种用于单管、实时检测且串扰低的多重LAMP技术的动力学正交设计

《Biosensors and Bioelectronics》：Antiphasic Arctangent-Arccotangent (AAA) probes: A kinetically orthogonal design for single-tube, real-time, and low-crosstalk multiplex LAMP

　　摘要：快速且精准地检测多种病原体对于有效控制疾病至关重要，但这一目标在即时检测（POCT）领域仍面临巨大挑战。本文提出一种新的探针设计策略——反相反正切-反余切（AAA）探针，通过环介导等温扩增技术，在单个封闭管中实现动力学正交、低串扰的多重检测。该AAA探针系统包含两种动力学互补的探针：能产生上升荧光信号的弧正切探针（ATP），以及能产生下降荧光信号的鸟嘌呤淬灭型线性探针（ACP）。这两种探针固有的反相动力学特性可有效降低非特异性扩增带来的假阳性结果。该系统无需额外酶或复杂操作，保持了传统LAMP方法的简洁性。作为概念验证，我们利用该系统同时检测了两种典型的蚊媒病原体——日本脑炎病毒和间日疟原虫，检测灵敏度达5拷贝/μL，且具有高特异性。该检测方法在临床样本及血清、组织匀浆等复杂基质中均表现稳定。除这种特定的双重检测外，AAA探针原理还为设计正交探针组提供了通用框架，为资源有限环境下的多重核酸检测提供了一种具有前景且应用广泛的策略。

引言：全球气候变化、生态格局变化以及快速城市化正在深刻改变传染病的传播规律，使得新出现和再次出现的病原体带来的威胁日益加剧（Ali等人，2024；Bartlett等人，2025；Diez Roux等人，2021；Dorsey，2025）。在此背景下，开发即时检测技术对于将疾病控制从被动应对转变为主动监测具有重要意义（Patel等人，2014）。由于操作简单且无需热循环，等温扩增技术已成为分布式核酸检测的核心技术（Georgakopoulou等人，2025；Rudroff，2025）。在重组酶聚合酶扩增、基于核酸序列的扩增、链置换扩增以及依赖解旋酶的扩增等多种现有技术中，环介导等温扩增因其独特优势而备受关注（Hellou等人，2021；Thompson和McMullen，2020；Yu等人，2022）。我们选择LAMP作为展示所提多重检测框架的载体，主要有两个原因。首先，从实际应用角度而言，LAMP具备出色的临床成熟度，能在复杂基质中抵抗抑制剂干扰，且采用单酶体系（Lamas等人，2023）。相比之下，RPA、NASBA和SDA通常需要多酶混合使用，这不仅会增加成本，还会增加检测优化难度。在新冠疫情期间，LAMP因获得多项紧急使用授权而进一步凸显了其实际优势（Qian等人，2017）。其次，从方法学角度而言，LAMP是对多重检测能力要求极高的技术。由于每个靶标需要4到6条引物，LAMP极易出现非特异性扩增问题，要在极其简单的单管体系中实现特异性多重检测面临极大挑战。成功解决LAMP中的这些长期存在的瓶颈，不仅能突破将其发展为可靠POCT工具的关键障碍，还能充分证明我们所提策略的通用性，为其在其他等温扩增平台上的应用奠定基础。在LAMP检测中，假阳性现象频发，主要是因为常见的检测策略依赖于非特异性扩增副产物产生的信号，比如焦磷酸镁沉淀导致的浊度变化（Mori等人，2001）、质子释放引起的pH值变化（Tanner等人，2015），或是双链DNA结合染料产生的荧光（如SYBR Green I、SYTO 9）（Tomita等人，2008）。尽管这类方法操作简单且成本低廉，但由于缺乏序列特异性，无法区分伪信号与真正的扩增产物（Qian等人，2017；Rolando等人，2020）。为解决这一问题，人们设计了序列特异性探针，将信号输出与靶标识别直接关联，从而从根本上排除非靶标信号。常见的此类策略包括DARQ探针（Tanner等人，2012）、分子信标（Gadkar等人，2018；Nyan和Swinson，2015；Xu等人，2022a、2022b）以及CRISPR相关系统（At?eken等人，2022；Dai等人，2025；Zhu等人，2022），这些方法都显著提升了单靶标LAMP检测的特异性。然而，要将这些探针策略应用于多重检测场景仍面临光谱串扰、动力学干扰以及探针特异性下降等问题（Hardinge和Murray，2019；Talap等人，2022）。目前的多重LAMP检测策略大致可分为三类。第一类是通过物理隔离手段，比如使用微流控芯片或侧向流动装置，将不同反应空间分开以避免相互干扰（Chen等人，2024；Wormald等人，2021）。但这种方法会增加设备的复杂度和制造成本。第二类则是利用不同的荧光或比色通道来实现多靶标检测，例如通过缩短淬灭探针长度实现的QUASR技术（Ball等人，2016；Priye等人，2017）、利用双功能二聚体和通用报告基因的介质置换LAMP技术（Becherer等人，2018、2020），以及基于多路交叉点的多重荧光探针技术（Sun等人，2023）。不过，这些方法往往存在信号串扰和动力学偏差的问题。第三类策略则是引入额外的酶促或识别步骤，比如Tth核酸酶（Higgins等人，2018）、多种限制性内切酶（Wang等人，2015、2016）或嗜热Argonaute蛋白（PfAgo）（Pang等人，2024），通过“扩增-识别”级联反应提升检测特异性。虽然这类方法可以实现单管多重检测，但需要多个步骤且成本较高，不符合“一酶一步”的理想检测模式。因此，目前仍存在一个关键缺口：一种真正实现单管、实时检测，操作简单度与单靶标检测相当，同时又能保持高特异性且不会带来过高成本的多重LAMP平台。近年来，可穿戴生物传感器和机器人诊断平台的发展，凸显出人们对兼具实时监测（Batra等人，2023；Safarkhani等人，2024）和/或体内监测功能、操作简单、高特异性，且适用于分布式医疗环境的诊断系统的迫切需求。虽然这些技术最初是为连续生化监测而开发的，比如用于无创监测的可穿戴葡萄糖生物传感器，以及用于检测气溶胶病原体的分子印迹聚合物传感器，但其设计理念与下一代核酸诊断技术的要求高度契合。正是这种契合推动了多重分子检测技术的发展，使得检测技术在保持优异分析性能的同时，也能满足即时检测的应用需求。在此，我们提出了一种“反相正交化”探针设计理念，并基于两种动力学正交的探针——弧正切探针和反余切探针，构建了一种新型的AAA探针系统。该系统的核心创新在于其双机制自我验证设计：弧正切探针是一种茎环结构分子信标，当靶标被扩增时会产生呈上升趋势的荧光信号，其信号变化规律类似弧正切函数；而反余切探针则是一种利用光诱导电子转移实现淬灭作用的单链探针，会产生呈下降趋势的荧光信号，其信号变化规律类似反余切函数。这两种探针在光谱特性上存在明显差异，且动力学轨迹完全相反、呈反相关系。这种内在的双机制设计确保了非特异性扩增极难同时引发两种相反的动力学响应，从而大幅降低了假阳性的发生概率。基于AAA探针的LAMP检测方法无需额外酶或扩增后的处理步骤，保持了传统LAMP方法的简洁性。作为概念验证，我们利用该框架同时检测了两种典型的蚊媒病原体——日本脑炎病毒和间日疟原虫，取得了较高的检测特异性，灵敏度可达5拷贝/μL。该检测方法在临床样本以及血清、组织匀浆等复杂基质中均表现稳定。除了这一具体应用之外，我们的研究还建立了一个可扩展的技术框架：通过合理设计具有独立机制和动力学特性的两种或更多探针，即可在单个反应管中构建出稳定、低成本且高度正交的多重LAMP检测系统。为了方便其他研究人员开发定制化的AAA-LAMP系统，我们还介绍了AAA探针的设计流程。这一策略为资源有限环境下的多重病原体筛查提供了实用解决方案，也为下一代即时检测技术的方法学发展做出了贡献。

材料与试剂：WarmStart? LAMP试剂盒（DNA和RNA版本）购自美国马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室；钙黄绿素和氯化锰购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司；琼脂糖、GelRed染色剂和TAE缓冲液购自中国上海的桑根生物技术公司；DL500 DNA标记购自日本滋贺县的TaKaRa公司。所有寡核苷酸均由桑根生物技术公司合成并纯化（引物通过PAGE技术纯化，探针通过HPLC技术纯化）。

含有日本脑炎病毒E基因和间日疟原虫Pvs25基因的质粒

用于反相多重检测的AAA探针系统设计：该AAA探针系统通过整合两种正交的分子探针——一种产生信号的反应型ATP探针和一种不产生信号的ACP探针——在单一LAMP反应体系中形成反相动力学轨迹，从而实现多重检测（见图1）。LAMP扩增反应在等温条件下由Bst DNA聚合酶催化进行，所产生的扩增产物会周期性暴露出环状引物序列，这些序列可作为探针的特异性杂交锚点。ATP探针是一种...

讨论：AAA探针解决了当前LAMP检测方法存在的诸多局限性。我们的实验数据表明，这种动力学正交的输出特征——ATP探针产生上升信号，ACP探针产生下降信号——为检测提供了彼此独立的信号通道，且几乎不受串扰影响（例如ROX→FAM信号的残留泄漏率仅为0.86%）。该AAA-LAMP方法对日本脑炎病毒和间日疟原虫的检测限均为5拷贝/μL，与单靶标LAMP方法的检测限相当。这些性能表现...

结论：在本研究中，我们开发并验证了一种基于AAA探针的多重LAMP检测平台。其核心创新在于“反相正交化”探针设计，该设计巧妙地将一种产生信号的反应型分子信标（ATP）与一种不产生信号的鸟嘌呤淬灭探针（ACP）相结合。这种内在的双机制交叉验证系统使得该平台能够在单个反应管中实现实时、低串扰的双靶标检测，即便在复杂样本中也能保持5拷贝/μL的高灵敏度和高特异性。

资助：作者衷心感谢上海市科学技术委员会高校能力建设项目（项目编号21010502800）、海军军医大学应用成果孵化项目（项目编号2024-RH01）、上海大学青年教师培养资助计划（项目编号10-26-112-005-066）以及上海科技大学研究生教学发展计划（项目编号10-25-115-004-007）提供的资金支持。

CRediT作者贡献声明：朱远寿：概念设计、数据整理、方法学研究、初稿撰写、审稿与编辑工作；徐希田：数据整理、正式分析、方法学研究、初稿撰写；黄梦源：数据整理、结果验证；陈雨欣：数据整理、方法学研究；司长强：数据整理、结果可视化；刘佳琪：数据整理、结果验证；何晨：资源提供；朱彦莉：资源提供；江宁：资源提供；李浩宇：结果可视化；王守龙：结果可视化；陈希毅：

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢：我们感谢上海科技大学的仪器分析中心为我们的研究提供的设施以及科学技术方面的支持。同时，也要感谢华南农业大学的黄立红博士和齐文宝教授在收集基因组样本方面给予的帮助。此外，我们还要感谢Biorender（Biorender.com）在实验过程中给予的协助。

朱远寿|徐希田|黄梦源|陈雨欣|司长强|刘佳琪|何晨|朱彦莉|江宁|李浩宇|王守龙|陈希毅|彭恒|刘科|陶胜策|朱志刚
中国上海200093，上海科技大学健康科学与工程学院