在长期睡眠受限的雄性小鼠中，AdipoRon治疗可调节下丘脑生物钟基因的表达、氧化应激以及与SIRT1/NRF2/HO-1相关的信号通路

《Brain Research》：AdipoRon treatment modulates hypothalamic clock-gene expression, oxidative stress, and SIRT1/NRF2/HO-1-related signaling in male mice subjected to chronic sleep restriction

　　

摘要

充足的睡眠对维持生物节律和代谢稳态至关重要，而慢性睡眠限制这一现代常见问题会扰乱下丘脑功能，进而导致昼夜节律紊乱、氧化应激以及代谢异常。本研究探讨了脂联素受体激动剂AdipoRon（AR）对慢性睡眠限制所引起的下丘脑时钟基因表达变化、氧化应激标志物以及SIRT1/NRF2/HO-1信号通路组分的影晌。实验将雄性小鼠分为对照组、慢性睡眠限制组、慢性睡眠限制加褪黑素组以及慢性睡眠限制加AR组。这些小鼠通过多平台方法经历21天的睡眠限制（每天18小时），同时每天接受鼻腔注射AR（10微克）或褪黑素（40微克），持续21天。研究检测了下丘脑中的时钟基因（Clock、Bmal1、Per1和Cry1）、氧化应激标志物（丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及总抗氧化能力），还有SIRT1/NRF2/HO-1通路的各组成成分。此外还测量了血清脂质谱和肝酶水平。研究结果表明，慢性睡眠限制会显著改变下丘脑与时钟相关的基因表达，同时增加氧化应激，并降低SIRT1/NRF2/HO-1通路相关蛋白的表达。此外，慢性睡眠限制还会降低体重增长速度和甘油三酯水平，同时升高低密度脂蛋白、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶的水平。相反，AR治疗可部分逆转慢性睡眠限制带来的时钟基因表达异常，减轻氧化应激，降低LDL和ALT水平，同时提高SIRT1/NRF2/HO-1通路相关蛋白的表达。这些发现表明AR可能有助于缓解慢性睡眠限制引发的分子和代谢异常，未来需进一步研究其作用机制。

引言

慢性睡眠限制指的是睡眠时间长期低于生理需求，通常为每晚7到8小时。其成因较为复杂，包括工作压力、个人生活习惯、睡眠障碍以及健康问题等。慢性睡眠限制会带来多种不良健康后果，比如认知功能下降、情绪紊乱，还会增加患代谢性疾病和心血管疾病的风险（Wagner和Born，2008；Wu等人，2019）。

睡眠通过促进记忆巩固、突触可塑性形成，以及清除β-淀粉样蛋白等神经毒性代谢物，来维持中枢神经系统的正常功能（Bishir等人，2020）。慢性睡眠限制会严重干扰这些过程，尤其是对作为代谢、应激反应以及昼夜节律调控核心的下丘脑而言影响更为显著。人体的昼夜节律由下丘脑前部的视交叉上核调控，该核负责协调体温、激素分泌以及24小时光照周期下的睡眠觉醒节奏（Goel等人，2013；Ramkisoensing和Meijer，2015）。关键的时钟基因包括Clock、Bmal1、Period（Per）和Cryptochrome（Cry），它们通过复杂的正负反馈循环共同维持昼夜节律。CLOCK: BMAL1蛋白会结合Per和Cry基因启动子中的E-box序列，推动这些基因的转录，随后产生的PER和CRY蛋白又会抑制CLOCK: BMAL1的活性，从而形成昼夜节律（Buhr和Takahashi，2013；Herzog等人，1998）。慢性睡眠限制会通过改变下丘脑时钟基因的表达，打破昼夜节律的平衡，使得机体内部生物钟与外界环境刺激不同步，进而引发代谢、情绪和认知方面的问题（Fifel等人，2018；Gillette和Tischkau，1999）。

昼夜节律的调控也与氧化平衡密切相关。活性氧和抗氧化能力都会出现昼夜波动，这反映了代谢过程与生物钟之间的动态相互作用（Budkowska等人，2022；Wilking等人，2013）。清醒状态下线粒体活性增强可能会增加活性氧的产生，而睡眠则能提升机体的抗氧化防御能力，促进活性氧的清除，从而减少氧化损伤（Davinelli等人，2024；Hartmann和Kempf，2023；Inoué等人，1995）。因此，无论是临床研究还是动物实验都表明，睡眠不足会导致抗氧化防御能力下降以及氧化还原失衡（Davinelli等人，2024；Everson等人，2005；Everson等人，2014；Farajdokht等人，2021；Ramanathan等人，2002；Salehpour等人，2018；Teixeira等人，2019）。

核因子红细胞2相关因子2是调控氧化应激反应的核心因子，同时也是连接昼夜节律与抗氧化防御的重要桥梁。在正常状态下，Keap1蛋白会将NRF2限制在细胞质中；但当出现氧化应激，比如慢性睡眠限制引发的氧化应激时，Sirtuin 1（SIRT1）脱乙酰酶会激活NRF2，使其转移到细胞核中，进而诱导血红素加氧酶-1、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的生成（Cuadrado等人，2019；Suzuki等人，2023）。也有证据表明，维持正常的昼夜节律依赖于SIRT1/NRF2通路（Davinelli等人，2024；Spiers等人，2019）。SIRT1不仅能够促进BMAL1和CLOCK等关键昼夜节律调控因子的转录，还能支持依赖NRF2的抗氧化信号传导，从而帮助维持氧化还原稳态的周期性变化（Chhunchha等人，2020；Pekovic-Vaughan等人，2014；Shi等人，2024；Wang等人，2016；Zhuang等人，2024）。在慢性睡眠限制的情况下，由于昼夜节律被破坏，NRF2/HO-1信号通路的功能也可能受到损害，进而加重氧化损伤（Nassan和Videnovic，2022；Villafuerte等人，2015；Xue等人，2019）。

褪黑素是一种主要在黑暗环境中由松果体合成的激素，它通过视交叉上核的信号传导，在协调睡眠觉醒周期以及强化昼夜节律方面发挥着重要作用（Hardeland，2018；Zisapel，2018）。除了具备调节生物节律的功能外，褪黑素还具有抗氧化和神经保护作用，这部分作用是通过激活SIRT1/NRF2通路实现的（Shah等人，2017）。不过，褪黑素的疗效相对有限且存在个体差异，其临床应用也受到不同人群反应不一致的制约（Ferracioli-Oda等人，2013）。这些局限性凸显出需要寻找具有更广泛、更强保护作用的替代疗法，用于应对睡眠功能障碍和氧化还原失衡问题。

脂联素是一种AMPK激活剂，近年来因其在调控代谢过程和昼夜节律方面的潜在作用而受到关注（Barnea等人，2009；Wada等人，2022）。其血液浓度会呈现昼夜波动，在傍晚时段下降，而在一天中的最初时段达到峰值，这种波动在一定程度上是由Clock和BMAL1蛋白调控的（Ando等人，2005；Barnea等人，2015）。脂联素还能通过AdipoR1受体上调下丘脑中基底部神经元的Bmal1蛋白表达，从而帮助代谢活动与昼夜节律保持同步（Tsang等人，2020）。值得注意的是，阻塞性睡眠呼吸暂停导致的睡眠片段化会降低脂联素水平（Bingol等人，2019），而更好的睡眠质量则与更高的血清脂联素水平相关（Magnusdottir等人，2021）。AdipoRon是一种人工合成的脂联素受体激活剂，由于能够穿过血脑屏障并发挥神经保护作用，被视为极具潜力的治疗候选药物（Nicolas等人，2018；Okada-Iwabu等人，2013）。它能够激活SIRT1/NRF2通路，提升抗氧化酶的表达并增强线粒体活性，从而帮助细胞抵御氧化应激（Alimohammadi等人，2025；Athari等人，2024；Azizifar等人，2024；Clain等人，2022）。鉴于慢性睡眠限制与氧化应激、昼夜节律紊乱之间存在关联，AR有望成为缓解这些不良影响的新策略。

虽然已有研究表明在正常状态下昼夜节律调控与NRF2/HO-1抗氧化通路之间存在关联（Pekovic-Vaughan等人，2014；Wible等人，2018），但这类研究大多是在没有睡眠限制的条件下进行的。此外，已有研究显示脂联素受体激活在其他模型中也能影响昼夜节律，并发挥抗氧化和神经保护作用（Tsang等人，2020），但它在慢性睡眠限制引发的下丘脑功能紊乱以及SIRT1/NRF2/HO-1信号通路中的作用目前仍不明确。因此，本研究旨在探讨鼻腔注射AR对慢性睡眠限制小鼠下丘脑时钟基因表达以及SIRT1/NRF2/HO-1信号通路的影响。

章节节选

实验动物

实验所用雄性瑞士白化小鼠共56只，年龄约8周，体重在25±5克之间，这些小鼠从伊朗德黑兰巴斯德研究所的动物饲养场获取。这些小鼠被饲养在温度为23±1摄氏度的动物设施中，光照与黑暗周期为12小时光照/12小时黑暗。动物随时可以获取水和饲料颗粒。每天上午7点灯光开启[时间参照点为0（ZT0）]。所有与实验中动物处理相关的操作均获得了

AR和褪黑素处理对慢性睡眠限制小鼠体重的影响

在为期3周的实验中，慢性睡眠限制导致了小鼠体重增长速度下降，而AR和褪黑素处理则部分恢复了正常的体重增长趋势（双因素方差分析：处理因素，F(3, 36)=25.31，p<0.001；时间因素，F(1.763, 63.49)=75.16，p<0.001；处理与时间的交互作用，F(9, 108)=6.359，p<0.001；见图2）。实验开始时各组小鼠的体重没有明显差异。但在睡眠限制开始一周后，慢性睡眠限制组小鼠的体重增长速度显著低于对照组，且这种差异在整个实验期间都持续存在

讨论

本研究表明，慢性睡眠限制会导致下丘脑中与时钟相关的基因表达下降，SIRT1/NRF2/HO-1信号通路功能减弱，同时氧化应激水平上升。相比之下，鼻腔注射AR与褪黑素类似，都能使时钟基因表达恢复到正常水平，增强抗氧化防御能力，并改善部分系统性代谢指标。这些发现提示，脂联素信号传导可能有助于维持下丘脑的分子稳态

结论

本研究显示，慢性睡眠限制会导致下丘脑中多个关键时钟相关基因的表达发生改变，包括Clock、Bmal1、Per1和Cry1。这些分子层面的变化伴随着脂质过氧化程度升高、抗氧化防御能力下降，以及SIRT1/NRF2/HO-1信号通路相关蛋白水平降低。而鼻腔注射AR和褪黑素则能使时钟基因表达恢复正常，同时提高SIRT1、NRF2相关蛋白的水平

数据可用性声明

支撑本研究结果的所有数据均整理在论文正文及其补充材料中。

CRediT作者贡献说明

Behzad Mansouri：文章撰写——初稿编写、方法学设计、实验实施、概念构思。Mohammad Reza Alipour： 。Gisou Mohaddes：文章撰写——审阅与编辑、定量分析、数据整理、概念构思。Beriwan Malaei：文章撰写——初稿编写、方法学设计、实验实施。Nasrin Hamidi：文章撰写——审阅与编辑、方法学设计。Ramin Hesami-Shabestari：方法学设计。Moein Hosseinkhani：方法学设计。Fereshteh Farajdokht：文章撰写——审阅与编辑、数据可视化、结果验证、研究监督，

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

本研究的资金支持来自伊朗大不里士医学科学大学神经科学研究中心颁发的编号为71894的资助项目。

Behzad Mansouri|Mohammad Reza Alipour|Gisou Mohaddes|Beriwan Malaei|Nasrin Hamidi|Ramin Hesami-Shabestari|Moein Hosseinkhani|Fereshteh Farajdokht

伊朗大不里士医学科学大学干细胞研究中心