《Clinical Microbiology and Infection》：Mutations in
MRR1 that confer fluconazole resistance in
C. parapsilosis and
C. albicans confer cross-resistance to manogepix
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摘要研究目的在导致侵袭性念珠菌病的两大病原体——白色念珠菌和近平滑念珠菌中，都已发现氟康唑耐药现象，这一现象部分是由MRR1基因突变所引起的，该基因编码的转录因子可调控药物外排泵的表达。研究发现，氟康唑与曼诺吉皮克斯的敏感性之间存在关联，后者是具有抗多数念珠菌种作用的新型抗真菌药
摘要
研究目的
在导致侵袭性念珠菌病的两大病原体——白色念珠菌和近平滑念珠菌中，都已发现氟康唑耐药现象，这一现象部分是由MRR1基因突变所引起的，该基因编码的转录因子可调控药物外排泵的表达。研究发现，氟康唑与曼诺吉皮克斯的敏感性之间存在关联，后者是具有抗多数念珠菌种作用的新型抗真菌药物的活性成分。本研究旨在确定导致这些病原体对氟康唑耐药的MRR1激活突变是否也会使其对曼诺吉皮克斯产生交叉耐药性。
研究方法
研究了白色念珠菌和近平滑念珠菌的临床分离株，以及经过工程改造、能够表达野生型或突变型MRR1等位基因的菌株，还有那些缺失了目标药物转运蛋白的菌株，检测了它们对氟康唑和曼诺吉皮克斯的敏感性。
研究结果
在近平滑念珠菌的临床分离株Cp13中引入Mrr1 I283R和A854V突变后，其氟康唑的MIC值从0.25毫克/升上升至32毫克/升，而曼诺吉皮克斯的MIC值则从0.008毫克/升上升至0.25毫克/升。而在对氟康唑耐药的临床分离株中，若将其MRR1基因恢复为野生型序列，氟康唑的MIC值分别从64、128和64毫克/升降至1、1和2毫克/升，曼诺吉皮克斯的MIC值则从0.125、0.25和0.125毫克/升降至0.015毫克/升。这一现象与编码Mdr1b和Cdr1b转运蛋白的基因有关。在白色念珠菌中，引入不同的MRR1激活突变后，其氟康唑的MIC值从0.5毫克/升上升至4–16毫克/升，曼诺吉皮克斯的MIC值则从0.015–0.03毫克/升上升至0.06毫克/升。在临床分离株中，激活突变使得氟康唑的MIC值从1–2毫克/升上升至32–64毫克/升，曼诺吉皮克斯的MIC值则上升了2到4倍。而在耐药分离株中，删除MRR1基因后，这些菌株又重新对这两种药物产生了敏感性。
研究结论
我们的研究结果表明，在近平滑念珠菌中，由MRR1激活突变导致的氟康唑与曼诺吉皮克斯之间的交叉耐药性是通过Cdr1b和Mdr1b转运蛋白介导的。在白色念珠菌中，MRR1激活突变也在一定程度上导致了交叉耐药性，但这种耐药性与Mrr1调控的药物转运蛋白无关。
引言
侵袭性念珠菌病会给住院患者带来严重的疾病负担和死亡风险[1]。虽然这类疾病主要由白色念珠菌引发，但越来越多的病例是由非白色念珠菌属的念珠菌物种引起的，其中包括近平滑念珠菌[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。在儿童和新生儿群体中，近平滑念珠菌已成为非白色念珠菌属感染的最常见病因[7]，尤其令人担忧的是，它逐渐对棘白菌素类和氟康唑产生了耐药性，而这两种药物正是治疗侵袭性念珠菌病最常用的抗真菌药。棘白菌素类被推荐作为一线治疗药物[8]、[9]，虽然在白色念珠菌中棘白菌素类耐药性相对少见，但在近平滑念珠菌中，由于固有耐药性和获得性耐药性的存在，使用这类药物变得十分复杂[10]、[11]。在白色念珠菌分离株中，对唑类抗真菌药氟康唑的耐药性较为罕见，但在非白色念珠菌属物种中则较为普遍。有研究显示，近平滑念珠菌的耐药率可高达80%，而且全球范围内都有因氟康唑耐药分离株引发的感染暴发报道[12]、[13]。
曼诺吉皮克斯是前药福斯马诺吉皮克斯的活性成分，这是一种极具潜力的抗真菌药物，目前正被用于治疗包括念珠菌属引起的严重真菌感染在内的多种疾病。曼诺吉皮克斯通过靶向该代谢途径中的关键酶Gwt1，来抑制糖基磷脂酰肌醇锚的生物合成[14]。目前尚未确立曼诺吉皮克斯的标准化敏感性阈值，但已确定白色念珠菌的野生型药物浓度上限为0.03毫克/升，近平滑念珠菌的该数值为0.06毫克/升[15]、[16]。此外，曼诺吉皮克斯的敏感性似乎与氟康唑的敏感性存在某种关联。
在白色念珠菌中，最近的研究表明，转录因子基因ZCF29的突变会影响曼诺吉皮克斯的敏感性，这类突变会导致ATP结合盒ABC转运蛋白基因CDR11和SNQ2的过度表达。在近平滑念珠菌中，线粒体的缺失会提升主要促进超家族转运蛋白基因MDR1的表达，进而影响曼诺吉皮克斯的敏感性[17]。在相关的酵母菌种耳念珠菌中，通过体外突变使得转录因子Tac1B发生D865N氨基酸替换，从而导致其对抗真菌药曼诺吉皮克斯的敏感性降低[18]。这一突变还会导致ABC转运蛋白基因CDR1的过度表达。如果缺失这两个基因中的任意一个，都会提升菌株对曼诺吉皮克斯的敏感性。基于这些观察结果，我们最近发现，TAC1B基因中的某些临床突变会通过CDR1的过度表达使菌株对氟康唑产生耐药性，同时也会降低耳念珠菌对曼诺吉皮克斯的敏感性；而在白色念珠菌和近平滑念珠菌的临床分离株中，TAC1基因的激活突变虽会导致氟康唑耐药性，但也会通过白色念珠菌中的CDR1和CDR2以及近平滑念珠菌中的CDR1A和CDR1C的过度表达，降低这些菌株对曼诺吉皮克斯的敏感性[19]。
编码锌簇转录因子的MRR1基因在这些念珠菌属物种的氟康唑耐药性形成过程中也起着重要作用。我们在白色念珠菌中证实，MRR1的激活突变会通过促使编码Mdr1 MFS转运蛋白的基因过度表达，从而增强氟康唑耐药性[20]。相比之下，我们在近平滑念珠菌中发现，虽然MRR1的激活突变也会导致编码MFS转运蛋白Mdr1和Mdr1B以及ABC转运蛋白Cdr1B的基因过度表达，但氟康唑耐药性实际上主要是由MDR1B和CDR1B的过度表达所驱动的[21]。鉴于MDR1在近平滑念珠菌的曼诺吉皮克斯敏感性中的作用，以及Cdr1家族的ABC转运蛋白在各类念珠菌属物种的曼诺吉皮克斯敏感性中的作用，我们推测，在近平滑念珠菌和白色念珠菌中，导致氟康唑耐药性的MRR1激活突变也可能会影响曼诺吉皮克斯的敏感性。
章节要点
菌株与分离株的培养条件
本研究所使用的菌株和分离株详细列表见表1。这些菌株通常在YPD培养基（Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯市）中于30摄氏度下培养，之后则储存在-80摄氏度、含40%甘油的溶液中。
敏感性测试
抗真菌药物敏感性测试是按照CLSI M27标准中的方法，通过肉汤微量稀释法进行的[22]、[23]。曼诺吉皮克斯（瑞士巴塞尔的Basilea Pharmaceutica公司生产）和氟康唑（Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯市生产）均先溶解在DMSO中，然后再进行进一步稀释。
近平滑念珠菌的MRR1激活突变会导致氟康唑耐药性，并升高曼诺吉皮克斯的MIC值
我们首先检测了那些携带从临床样本中获得的MRR1激活突变的近平滑念珠菌菌株对曼诺吉皮克斯的敏感性，这类突变会促使MDR1基因过度表达，进而导致氟康唑耐药性的产生。此前我们已经证明，将MRR1I283R或MRR1A854V突变引入敏感的临床分离株Cp13后，能够分别使MDR1、MDR1B和CDR1B基因的表达水平提升14.33倍、9.41倍和5.82倍至4.35倍，同时还伴随着其他相关基因表达的变化。
讨论
在世界卫生组织2022年发布的真菌重点病原体名单中，白色念珠菌被归为“关键”类别，而近平滑念珠菌则被列为“高优先级”类别[25]。虽然白色念珠菌临床分离株中氟康唑耐药性较为罕见，但在许多地区，近平滑念珠菌的氟康唑耐药性却已日益成为一项严重的临床问题，有研究报道其耐药率甚至可达80%[12]、[13]。造成这种差异的一个主要原因是……
贡献
K.S.B.参与了研究设计、数据分析、数据整理与可视化以及论文撰写工作。H.P.P.负责实验研究与数据整理。J.M.参与研究设计及论文撰写。N.P.W.参与了研究设计、实验研究、数据整理、数据分析以及论文撰写。P.D.R.则负责研究设计、数据分析、资金筹集以及论文撰写。
关于本稿撰写过程中是否使用生成式人工智能及人工智能辅助技术的相关声明
在撰写本篇论文的过程中，没有使用任何人工智能或人工智能辅助技术。
资金支持
本研究得到了美国国立卫生研究院向P.D.R.提供的R01 AI058145号资助，同时也部分得到了美国国立卫生研究院下属的国家癌症研究所向圣裘德儿童研究医院哈特威尔中心提供的P30 CA021765号资助。
致谢
作者感谢Keith A. Laycock博士对本文的学术编辑工作。
Katherine S. Barker|Hoja P. Patterson|Joachim Morschh?user|Nathan P. Wiederhold|P. David Rogers
美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院药学与制药科学系
