干血斑（Dried Blood Spot, DBS）结合液相色谱-高分辨质谱（Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry, LC-HRMS）工作流用于同步鉴定新型阿片类物质的方法学验证

《Forensic Science International》：Validation of a Dried Blood Spot (DBS) liquid chromatography – high-resolution mass spectrometry (LC-HRMS) workflow for simultaneous identification of emerging opioids

　　

新型合成阿片类（包括芬太尼类似物与硝嗪类）的快速涌现是重大公共卫生问题。其高 potency 与持续结构修饰要求分析手段具备高灵敏度与可适应性。研究人员评估了干血斑（DBS）采样作为常规液体基质在合成阿片鉴定中的稳健替代方案。研究建立并验证了基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的方法，数据采集采用全扫描数据依赖采集（full-scan Data-Dependent Acquisition, DDA）模式。该 DBS–LC-HRMS 联合方法适用于已知芬太尼类似物与硝嗪类的检测，并可通过数据分析鉴定潜在未知物。检测限（Limit of Detection, LOD）与定量限（Limit of Quantification, LOQ）分别为 0.05–0.2 ng/mL 与 0.1–0.75 ng/mL，所有分析物线性范围 0.5–3 ng/mL。稳定性评估显示 DBS 在 7 天期内较冷冻全血更稳健经济。方法成功应用于真实样本，确认其作为法医毒理学筛查工具的可行性，可对 37 种合成阿片进行鉴定与定量，为应对非法合成阿片动态演化提供了灵活高效的常规化策略。

研究背景与立题依据

近年来，新型合成阿片类（synthetic opioids）在非法药物市场持续涌现，因其极高效价（potency）、结构快速演化及与致死性过量高度相关，已成为关键公共卫生挑战。联合国毒品和犯罪问题办公室（UNODC）数据显示，合成阿片使用规模居非法药物第二，且阿片类占药物直接相关死亡约三分之二。本研究聚焦最具影响的芬太尼类似物（fentanyl analogues）与硝嗪类（nitazenes）：芬太尼效价约为吗啡 50–100 倍，部分硝嗪类临床前研究报道效价达吗啡数百至千倍以上。因高 poten cy，生物样本中常仅存极低浓度，传统毒理筛查在死后样本等场景中易假阴性。常规血液、血浆等液体基质存在需专业人员采集、生物危害、冷链依赖、现场采样受限等缺陷。干血斑（Dried Blood Spot, DBS）技术以微量采血、室温干燥、免冷藏、普通邮寄、低生物危害等优势，成为颇具潜力的替代基质。研究人员旨在验证 DBS 耦合 LC-HRMS 工作流对芬太尼类似物与硝嗪类同步鉴定与定量的适用性，论文发表于《Forensic Science International》。

主要技术方法概括

研究人员采用 QIAGEN QIAcard 血迹卡采集 DBS，以药物空白人全血加标构建校准与质控体系，每样本分三个 30 μL 斑点室温干燥后整斑剪取，甲醇/0.1% 甲酸超声提取，加内标 fentanyl-D5，氮吹复溶后进样。仪器端使用 Orbitrap Exploris 120 高分辨质谱仪耦联 Vanquish HPLC，Raptor Biphenyl 柱，流动相为含 5 mM 甲酸铵与 0.1% 甲酸的水（A）及含 0.1% 甲酸的甲醇（B），正离子 H-ESI 源，全扫描 m/z 100–500（分辨率 120,000）配合靶向质量表的数据依赖二级（ddMS2/HCD）采集。验证参数涵盖选择性、LOD、LOQ、线性、精密度准确度、回收率、基质效应及 7 天稳定性；真实样本来自 10 例接受芬太尼治疗患者的常规血涂 DBS。

研究结果

3.1 方法验证：以 10 份阴性 DBS 评估选择性无内源干扰；校准初设 0.05–3 ng/mL，因低于 0.5 ng/mL 部分分析物准确精密度不达标，最终线性锁定 0.5–3 ng/mL。LOD 0.05–0.2 ng/mL（protonitazene 例外 0.5 ng/mL），LOQ 0.1–0.75 ng/mL（protonitazene 0.75 ng/mL），方法定位于痕量识别。

3.2 精密度与准确度：在 1.5 与 3 ng/mL 两个 QC 水平，绝大多数分析物日内/日间 CV%≤20%，E% 多在 ±20% 内；etonitazepipne、butonitazene、furanyl norfentanyl 等少数偏差较大（最高 E% 约 ±58%），但整体满足法医筛查容忍度。

3.3 基质效应：多数分析物呈信号增强（ME%>100%），常稳定在 80–120%，高 QC 下少数 ME% 超 200–250%；提示 DBS 纸基质与提取液引入的离子化影响以增强为主，与其余文献常见抑制不同。

3.4 回收率：芬太尼类似物绝对回收率多 70–130%，硝嗪类偏低，protonitazene 仅 55%，反映化合物极性、蛋白结合及纤维素亲和差异。

3.5 稳定性：7 天室温 DBS 与 ?20 ℃ 冷冻全血对比，两者偏差多 20–50%，但冷冻全血下降幅度总体等于或大于 DBS，DBS 在免冷链前提下保存完整性不劣于冷冻血。

3.6 真实样本应用：10 例芬太尼治疗者 DBS 中检出 fentanyl 0.13–0.50 ng/mL，1 例阴性，3 例介于 LOD–LOQ 间只能定性不能定量，norfentanyl 均 < />

讨论与结论翻译

讨论指出，DBS–LC-HRMS 可同步识别 37 种阿片新精神活性物质（NPS），HRMS 全扫描 DDA 兼具准确质量、丰富碎片与回溯再处理潜力，未知类似物亦可事后挖掘。DBS 较液体血简化采集运输、降生物危害；全斑提取缓解了 hematocrit 导致的穿刺体积偏差，但死后血黏度/溶血/凝血仍可能引入残留偏倚。基质效应以增强为主，回收率因化合物而异，强调按化合物单独验证及使用结构匹配内标。7 天稳定性实验显示 DBS 保存不劣于冷冻全血，但部分物显著降解，提示短时稳定性亦需化合物级评估。欧洲（含意大利）真实案例稀缺使验证以加标为主，但真实治疗血样已佐证方法可用，且治疗浓度与中毒/致死浓度同量级或更低，说明更高浓度亦能覆盖。

结论部分译文：

鉴于新型合成阿片持续涌现与结构演化，建立能在低浓度检测此类化合物的联用分析方法至关重要。常规筛查与靶向方法常漏检未报告或结构修饰物，而高分辨质谱（HRMS）提供宽口径灵活策略，可同时覆盖已知与潜在未知类似物；全扫描 DDA 模式使原始数据具回溯再处理价值。干血斑（DBS）进一步赋予样品处理实操优势。本研究方法特意锚定极低浓度区间，可可靠识别该类化合物并容忍收样后稳定性损失。综上，所提 DBS–LC-HRMS 方案为广谱合成阿片分析提供操作优势，展现出面向常规法医毒理学应用的潜力。

Serena Mestria、Sara Odoardi、Valeria Valentini、Giulia Biosa、Sabina Strano-Rossi 等完成本工作，单位系意大利罗马 Università Cattolica del Sacro Cuore Fondazione Policlinico Gemelli IRCCS 健康监护与生命伦理系法医毒理学实验室。