《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：NN-assisted image analysis for quantifying intracellular Trypanosoma cruzi infection
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细胞内克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）感染的定量仍然是查加斯病（Chagas disease）研究和早期药物发现中一个核心且方法学上具有挑战性的步骤。当前方法主要依赖于基于手动显微镜的计数或基因修饰的寄生虫，两者在可扩展性、可重复性或可及性方面均
细胞内克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）感染的定量仍然是查加斯病（Chagas disease）研究和早期药物发现中一个核心且方法学上具有挑战性的步骤。当前方法主要依赖于基于手动显微镜的计数或基因修饰的寄生虫，两者在可扩展性、可重复性或可及性方面均存在局限性。在此，研究人员开发并验证了一个基于神经网络（NN）的流程，用于使用仅用DNA结合荧光染料染色的图像自动量化哺乳动物细胞中的感染率和寄生虫载量。两个独立优化的深度学习模型分别被微调以分割宿主细胞核和细胞内无鞭毛体（amastigotes），随后整合到一个统一算法中，该算法将每个寄生虫分配给其最近的宿主细胞。该流程使用感染两种克氏锥虫（T. cruzi）菌株的六种哺乳动物细胞系的共聚焦图像进行评估，并与盲法手动量化进行比较。宿主细胞核和寄生虫的自动检测与手动计数显示出高度一致性，中位偏差约为5%，且每个细胞的寄生虫载量分布相似。与基于形态学的图像分析方法相比，研究人员的基于NN的方法在多种细胞类型和染色条件下表现出更强的鲁棒性，减少了参数依赖性，并实现了宿主和寄生虫对象的独立分割，最小化了误差传播。尽管观察到寄生虫到细胞分配存在轻微偏差，但自动化工作流程准确量化了感染细胞的百分比和每个细胞的无鞭毛体数量，通过精确率/召回率指标和Bland–Altman分析评估，显示出高检测性能并与手动量化高度一致。这种可访问且可扩展的AI辅助工作流程为手动量化提供了可重复的替代方案，代表了针对细胞内克氏锥虫（T. cruzi）标准化表型筛选的方法学进展，支持查加斯病（Chagas disease）药物发现中更稳健和协调的努力。
查加斯病（Chagas disease）是由原生动物寄生虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的被忽视热带病，其细胞内无鞭毛体（amastigote）阶段是药物开发的主要靶点。现有药物苯硝唑（Benznidazole, BNZ）和硝呋替莫（Nifurtimox, NFX）在急性期有效，但慢性期疗效有限且副作用显著，亟需新疗法。然而，评估细胞内感染的常用方法——手动显微镜计数（耗时、主观性强、可重复性差）和基因修饰寄生虫（仅提供相对感染率，缺乏细节）——限制了药物筛选的规模和标准化。为解决这一方法学瓶颈，研究人员开发并验证了一个基于神经网络（NN）的自动化流程，利用仅DNA结合荧光染料染色的图像，实现哺乳动物细胞中克氏锥虫感染率和寄生虫载量的定量。该研究发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。
关键技术方法（不超过250字）：使用Cellpose-SAM作为基础分割模型，通过人类在环（human-in-the-loop）训练方案微调。训练数据集包含多种条件：不同细胞系（Vero、HeLa、Caco2、C2C12、BeWo、THP-1）、两种T. cruzi菌株（Tulahuen和Dm28c）、显微镜模式（宽场和共聚焦）、图像格式（灰度和RGB）及放大倍数（20×–60×）。宿主细胞核模型使用7863个感兴趣区域（ROIs）来自76张图像，寄生虫模型使用9254个ROIs来自87张图像。验证数据集为59张共聚焦图像（512×512像素，40×物镜加1.5倍变焦，总放大60×），源自同一实验，未用于训练。手动量化由至少两名操作员进行，计算组内相关系数（ICC）。算法流程：分别分割后，计算每个寄生虫质心到所有宿主细胞核质心的距离，分配给最近细胞，生成每个细胞寄生虫数和图像汇总统计。
研究结果：
Neural network refinement for mammalian cell detection：通过微调，模型从检测宿主细胞核时易将无鞭毛体信号误并入核掩码，改进为仅识别宿主细胞核，与特异性抗T. cruzi染色的重叠从8.63%降至1.81%，验证了模型对宿主核的准确分割能力。
Model refinement for T. cruzi amastigote identification：经过多轮微调，模型忽略宿主细胞核，准确检测无鞭毛体，并避免将单个无鞭毛体的核和动基体（kinetoplast）分割为多个实例。最终模型在验证数据集上达到精确率0.86、召回率0.89、F1分数0.85、交并比（IoU）0.55。88.4%的自动检测掩码与特异性抗T. cruzi通道共定位；在未感染细胞中，假阳性数不显著高于手动计数（除Caco2和THP-1细胞系）。
Algorithm development for quantification of infection rates and parasite burden：开发了整合两个模型的算法：先对宿主细胞核和无鞭毛体进行实例分割，再通过质心距离将每个寄生虫分配给最近细胞，输出每个细胞的寄生虫数和每张图像的汇总统计，并生成可视化质量控制图。
Algorithm validation：使用独立验证数据集（59张图像）评估。与手动量化相比，自动检测无鞭毛体轻微低估，中位偏差约5%；宿主细胞核检测高度一致。与基于形态学的INsPECT算法相比，NN方法偏差更小且更稳定，宿主细胞核误差与寄生虫误差的相关性更低（Pearson系数0.30 vs 0.72），表明独立分割优势。Bland–Altman分析显示，每个细胞平均无鞭毛体数的平均偏倚为0.07（95%一致性界限：-2.38至2.54）；感染细胞百分比的平均偏倚为9.4%（界限：-26.9%至45.7%），但偏倚随视野细胞数增加而减小，当按实验条件汇总时平均偏倚降至1.5%（界限：-14.4%至17.3%）。在生物学输出比较中，两种方法在每个细胞平均无鞭毛体数、感染比例、感染指数等方面相似，但自动方法因距离分配导致寄生虫更均匀分布，使感染细胞比例略微高估、每个感染细胞的无鞭毛体数略微低估。总体直方图显示自动方法在单寄生虫感染细胞中计数更高，手动方法分布更平坦。
讨论部分总结：本研究开发的基于NN的自动化流程解决了查加斯病研究中的方法学空白，通过独立微调宿主细胞核和寄生虫模型并整合，提供了客观、可重复、高通量的感染率和寄生虫载量测量。与形态学方法（如INsPECT）相比，该方法更易实现、对采集参数不敏感，且在不同细胞系和菌株中结果一致。选择Cellpose-SAM作为分割工具，因其专为荧光细胞图像设计且参数调整少，但需微调以适应T. cruzi感染特征。局限性包括：在染色不佳、信噪比低或目标稀少的图像中准确性下降；寄生虫分配倾向于均匀分布导致感染率轻微高估，但通过组合多个视野可减轻该效应。总体而言，该方法提供了与手动方法相当的准确性，且具有可扩展性和可重复性，可适应其他细胞内病原体。
研究结论：综上所述，基于NN的细胞内T. cruzi感染自动定量提供了一种实用且可及的解决方案。通过实现与手动方法相当的准确性，同时提供可扩展性、可重复性和减少操作员偏倚，该工作流程超越了当前方法的局限性。由于该工作流程基于微调预训练的Cellpose-SAM模型，相同的微调策略可通过生成任务特定标注数据集，适应其他细胞内病原体或成像条件。将其整合到药物发现流程中，有望减少化合物评估时间，协调实验室间方案，并促进旨在为这一持续且服务不足的公共卫生威胁寻找新疗法的合作努力。
