亲和力调节的抗独特型掩蔽技术，可生成具有优化掩蔽-未掩蔽动态范围的蛋白酶激活型HER2靶向抗体

《Journal of Biological Engineering》：Affinity-tuned anti-idiotypic masking enables protease-activatable HER2-targeting antibodies with an optimized masked–unmasked dynamic range

　　

摘要

背景

可激活抗体通过一个掩蔽结构域来抑制抗原结合，从而降低在靶点处的非肿瘤毒性，该掩蔽结构域只有在遇到与肿瘤相关的刺激时才会被释放。针对母体抗体的互补决定区（CDRs）制备的抗独特型单域抗体（dAb）是一种理想的掩蔽模块，因为它们可以通过天然且结构明确的抗体-抗体界面与抗原的副表位结合。然而，正是这种高内在亲和力使得这类掩蔽结构能够在蛋白酶切割连接掩蔽结构与抗体的链段后仍有效阻止抗原结合的完全恢复。在此，我们通过结构引导的亲和力调控，将抗曲妥珠单抗的dAb掩蔽结构与抗HER2的4D5单链可变片段（4D5scFv）融合，以此解决这一限制。

结果

通过对dAb与曲妥珠单抗的晶体结构（PDB ID 7PKL）的分析，发现dAb中的Y61和W104是掩蔽界面上的主要锚定残基。初步的丙氨酸扫描显示，野生型结构在切割前能有效抑制HER2结合，但在烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割后无法恢复结合能力，而单个突变体Y61A和W104A则能使掩蔽完全解除。Y61A/W104A双突变体则完全失去了掩蔽功能。在对作用更强的W104位置进行进一步优化（W104A、W104L、W104F）后，发现W104F是最优变异体，它能使掩蔽状态与未掩蔽状态的动态范围达到约22倍，这一数值是通过未切割的W104F与经TEV切割后的W104F的EC₅₀值之比计算得出的，同时还能保持抗原结合的完全恢复。将TEV切割位点替换为基质金属蛋白酶-9（MMP-9）切割位点后，这种特性在肿瘤相关环境中依然存在：dAb(W104F)-MMP-9-4D5scFv在缺乏MMP-9的情况下能将HER2结合能力抑制约125倍，而在经过切割后，其结合能力可恢复到接近母体4D5scFv的3倍水平。BLI分析还显示，经过MMP-9处理的dAb(W104F)-MMP-9-4D5scFv仍具有可检测的HER2结合能力，其表观K_D值为10.0 nM，而在相同实验条件下，dAb(WT)-MMP-9-4D5scFv以及未切割的dAb(W104F)-MMP-9-4D5scFv则无结合能力检测到。在针对HER2阳性的BT-474细胞进行的细胞结合试验中，只有W104F结构体表现出明显的MMP-9依赖性细胞结合，而野生型结构体在两种条件下均无活性。值得注意的是，即使在含有10% FBS的条件下，也能确认存在MMP-9依赖性切割现象，而且对反应产物进行的抗HER2 ELISA检测也显示出W104F结构体的HER2结合能力有所恢复。

结论

通过对抗独特型dAb掩蔽结构进行结构引导的亲和力调控，为可蛋白酶激活抗体提供了一种可行的设计思路，这样的抗体具有明确的掩蔽与未掩蔽状态之间的动态范围，并能在肿瘤相关条件下实现蛋白酶依赖性激活。这一框架在概念上可推广到其他抗独特型掩蔽结构-抗体对，也为那些因靶点处非肿瘤毒性而限制其临床应用范围的抗体提供了扩大治疗窗口的合理途径。