引言
实验性前生物化学研究旨在为生命起源假说提供依据，通常会探讨信息聚合物是先于自我维持的代谢网络出现，还是反之[1]。在关于生命起源于信息的第一类假说中，RNA世界假说较为常见，但并未被普遍接受[[2], [3], [4], [5]]。该假说认为地球上的最初生命是由在池塘环境中形成的能够自我复制的核糖核酸构成的。要证明这一假说的合理性，关键在于在模拟早期地球条件的实验室中合成RNA。火花放电法（即米勒-尤里实验）和等离子体实验是研究形成RNA的前生物化学原料的常用方法[[6], [7], [8], [9], [10]]。这类实验面临的一个主要技术难题是，如何找到一种准确且灵敏的方法来分析实验中的池塘混合物，从而确定其中究竟产生了何种物质。由于前生物化学实验可能产生仅在质量上类似RNA、但缺乏核糖、核碱基或磷酸基团、因而并非完整RNA的半组装分子，结构确定性至关重要。液相色谱-质谱法是一种能够区分分子结构的分析方法，但由于极性差异以及保留时间相近的原因，该方法在分离RNA的各组分——如核碱基、核苷、核苷酸和短RNA寡聚体时存在困难[[11], [12], [13]]。在本研究中，我们利用超高性能液相色谱-Orbitrap MS这种高分辨率、高灵敏度的仪器，为分析前生物化学溶液奠定了基础。我们研究了多种参数和方案，以优化分离效果和检测灵敏度，包括色谱柱和洗脱梯度、溶剂选择、电离模式以及碰撞能量等。本研究旨在为那些希望使用此类仪器分析RNA构成成分的实验室提供参考。目前的研究重点是利用分析标准物开发分析方法，尚未对实际前生物化学样本的分析性能进行评估。
早期用于分析核碱基、核苷、核苷酸和短RNA寡聚体的方法包括凝胶电泳和核磁共振波谱法。虽然凝胶电泳操作简单且成本低廉，但它只能提供分子大小的大致信息，无法确定复杂反应混合物中各种产物的确切结构[14]。核磁共振波谱法虽能提供有价值的结构信息，但其成本较高，且对于含量较低的分析物灵敏度不足[15]。此外，前生物化学实验产生的反应混合物十分复杂，会导致核磁共振谱图中出现大量重叠峰。液相色谱-质谱法的出现带来了重大突破，如今已被广泛应用，它结合了高效的分离能力和精确的结构解析功能，大幅提升了检测限和选择性[[16], [17], [18], [19], [20]]。
在各类现代分析技术中，UHPLC因其更高的分辨率、更短的分析时间以及更好的峰分离效果而成为首选方法[18,[21], [22], [23], [24], [25]]。与传统的高性能液相色谱系统相比，后者的工作压力通常在400巴左右，而UHPLC系统的压力可高达1000巴以上。这一特点使得可以使用粒径更小的色谱柱，进而提升色谱效率、峰容量以及分析时间[18]。当UHPLC与高分辨率质谱仪（如Orbitrap系列）结合使用时，还能进一步提升检测能力，因为它具有极高的质量精度、更好的结构解析能力，以及对低含量分析物更高的灵敏度[16,26]。
目前用于分析核碱基、核苷和核苷酸的液相色谱最常用的是反相液相色谱法，该方法采用非极性固定相，具有高度的通用性、准确性和灵敏度[[27], [28], [29]]。然而，核苷酸及其相关的磷酸化化合物极性很强，在常规反相色谱条件下往往保留能力较弱。为解决这一问题，研究人员开始使用亲水作用液相色谱法，该方法能更好地保留极性分析物。在各类亲水作用液相色谱柱中，酰胺基色谱柱因能与水基流动相兼容，且能够保留腺苷一磷酸、二磷酸和三磷酸等含磷酸的分析物，而被广泛使用[20,24,27]。不过这类色谱柱也存在一些缺陷：有研究表明某些核苷酸（如ADP、ATP）的保留时间不稳定，且会出现峰拖尾现象[18,30,31]。这些问题凸显出在全面分析RNA构成成分时，需要进一步优化色谱柱的选择。为克服这些局限，人们开发出了新的液相色谱硬件和色谱柱技术，以减少磷酸化分析物与金属表面的相互作用。本研究中使用的Atlantis Premier BEH Z-HILIC色谱柱采用了MaxPeak高性能表面技术，该技术旨在最大限度地减少含磷酸化合物的吸附，从而提升色谱回收率和峰形质量[13,30]
除了色谱柱技术方面的进步，流动相选择的改进也进一步提升了核苷酸分析的效果。在许多研究中，铵类添加剂因能够改善峰形、提高电离效率，以及减少质谱分析中的离子抑制效应，而被视为理想的缓冲剂[25,32]。与甲酸铵和甲酸这类替代品相比，醋酸铵和碳酸氢铵能更好地保留和分离核苷酸，因此成为现代液相色谱-质谱分析方法中需要重点考虑的因素[22,24,25]。
在本研究中，我们开发并优化了利用UHPLC-Orbitrap MS检测RNA构成成分的分析方案。我们针对色谱柱和洗脱梯度、溶剂选择、电离模式以及碰撞能量等关键参数进行了评估，旨在建立一套稳定的分析框架。在确定最优分析方案时，我们主要考虑了三个因素：1）所有色谱峰都能实现完全且同步的分离；2）峰形窄、对称且特征明显，便于定量分析；3）分析流程高效且重复性好，能够在大约30分钟内得出分析结果。通过不断优化这一分析方法，我们期望提升前生物化学实验中RNA构成成分的检测能力及其结构确认的准确性，同时为多个科学领域提供应用支持。
Mia E. Trodden|Mariana C. Aguilar|Ishaan Madan|Ben K.D. Pearce
