《Journal of Comparative Pathology》：Do we agree on counting mitotic figures in cytology of canine lymphoma? Three field selection methodologies by three observers
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摘要有丝分裂计数是评估犬淋巴瘤细胞学特征的关键参数，但目前尚无统一的计数标准。细胞学涂片中的细胞保存状况存在差异，这可能影响有丝分裂计数的重复性。我们比较了三种用于选择犬淋巴瘤细胞学涂片中有丝分裂计数视野的方法，并评估了不同观察者之间的一致性。三名观察者在19例犬淋巴瘤样本的5个
摘要
有丝分裂计数是评估犬淋巴瘤细胞学特征的关键参数，但目前尚无统一的计数标准。细胞学涂片中的细胞保存状况存在差异，这可能影响有丝分裂计数的重复性。我们比较了三种用于选择犬淋巴瘤细胞学涂片中有丝分裂计数视野的方法，并评估了不同观察者之间的一致性。三名观察者在19例犬淋巴瘤样本的5个高倍视野中进行了有丝分裂计数，所选视野依据以下方法：（A）随机选取且细胞保存良好的视野；（B）选取细胞保存最良好的单层区域内的相邻视野；（C）选取有丝分裂活性最高的区域。计数结果既以5个高倍视野中的总数表示，也以每平方毫米的数值表示；根据已公布的阈值，有丝分裂计数被分为低、中、高三类。方法A和B的计数结果相当，而方法C的计数值始终较高。总体而言，21%的病例的有丝分裂计数分类发生了变化，使用方法C时更多病例被归为高类别。不同视场直径的显微镜所对应的观察者之间的一致性较差，而将计数值标准化为每平方毫米数值后，一致性有所提升。与随机选取视野相比，选取相邻视野的计数方法具有更好的观察者间一致性。不过，在高度增殖的犬淋巴瘤病例中，不同观察者记录的数值差异较大。这些数据表明，犬淋巴瘤细胞学涂片中的有丝分裂计数在很大程度上取决于视野选择方法以及所用显微镜。
引言
细胞学是一种经济高效且可靠的诊断方法，尤其适用于及时诊断犬淋巴瘤，尤其是涉及淋巴结的情况。对肿瘤性淋巴细胞的细胞学诊断主要依赖于核特征，包括有丝分裂图像、核大小（相对于红细胞大小判断）、核形状、染色质密度、核仁形态、细胞质延伸程度以及嗜碱性等特征[[1], [2], [3], [4], [5]]。
有丝分裂图像计数虽是一种重要的诊断工具，但属于耗时过程，且结果可能存在差异，尤其是在细胞学涂片上进行分析时[6]。这种差异源于细胞保存不良以及细胞分布不均等因素[5]。犬淋巴瘤的有丝分裂活性阈值是通过统计细胞学标本中的有丝分裂图像确定的，通常根据5个高倍视野中的有丝分裂图像数量将其分为低（≤1）、中（2–4）和高（≥5）三级[2,3,5,7]。不过，不同文献中关于视野数量及有丝分裂活性阈值的设定存在差异，有些研究采用了不同的阈值标准（例如，低级别为0–2，中级为3–5，高级为≥6，且是在10个高倍视野中统计有丝分裂计数）[8]。在犬淋巴瘤的组织学检查中，有丝分裂计数与生存率之间存在显著相关性，可作为重要的独立预后指标，这一特点与其他犬类肿瘤如皮肤肥大细胞瘤类似。然而，目前用于犬淋巴瘤细胞学检测的有丝分裂计数阈值是基于组织学病例系列的数值分布确定的，旨在反映组织学分级，而非通过大规模前瞻性队列的直接生存率关联来制定[2,7]。因此，目前用于犬淋巴瘤细胞学检测的有丝分裂计数阈值的预后价值尚未得到证实[9]。
在一项针对T细胞淋巴瘤的研究中，细胞学检测显示每5个高倍视野中有丝分裂图像少于10个的犬只，对诱导化疗的反应率更高，这说明较低的有丝分裂活性可能与更好的治疗结果相关[10]。另一项研究则发现，有丝分裂计数与各种结局变量（从诊断到缓解的时间、从缓解到复发的时间、从复发到死亡的时间以及总生存率）均无显著关联[11]。
目前，细胞学仍是诊断犬淋巴瘤的主要甚至唯一的诊断方法[12,13]。当宠物主人担心费用问题，或肿瘤科医生认为手术切除淋巴结可能会延迟化疗时，这一情况更为常见。很多时候，仅通过细胞学检查不仅能实现及时诊断，还能为后续检测提供基础，比如用于检测抗原受体重排的聚合酶链反应以及免疫细胞化学检测。此外，还可以对细针穿刺取得的样本进行流式细胞术分析。所有这些技术都属于微创操作，不仅有助于诊断犬淋巴瘤，还能用于特征分析[[13], [14], [15], [16], [17]]。
诊断和分级犬淋巴瘤的金标准是通过对淋巴结活检样本进行组织学检查，通常还会结合免疫组化分析。在组织学检查中，通常会在有丝分裂图像最多的区域（即所谓的高活性区域）进行计数，同时会在多个区域重复计数以确保结果的准确性[9]。世界卫生组织的分级系统被广泛用于犬淋巴瘤的诊断，但目前尚不确定细胞学涂片中的有丝分裂计数是否与淋巴结活检所得结果具有良好的相关性[9]。在那项显示细胞学检测显示有丝分裂活性较低的T细胞淋巴瘤对诱导化疗反应更好的研究中，并未对细胞学涂片中的有丝分裂计数与相应的组织学样本进行相关性分析[10]。
在组织病理学中，显微镜视野直径对有丝分裂计数具有重要影响，这一原则已有明确规范，也因此形成了严格的标准化指南，但在兽医细胞学领域却缺乏此类标准化措施[18,19]。目前的细胞学分级系统往往仅依据5个高倍视野中的计数结果，而不明确视野直径的标准。尽管视野直径的差异可能改变有丝分裂活性的分类结果，但目前对其在细胞学分级中造成的误差程度尚无准确量化。本研究的主要目的是比较通过三种不同方法（随机选择、连续选择和高活性区域选择）在5个高倍视野中获得的有丝分裂计数结果，同时利用已有的阈值标准，评估绝对有丝分裂计数、每平方毫米有丝分裂图像数量以及有丝分裂分级结果在不同观察者之间的差异。通过这项初步研究，我们希望凸显视野选择对犬淋巴瘤有丝分裂活性细胞学评估的影响，进而引发关于细胞学中有丝分裂计数标准化的讨论，以及进一步验证这一增殖参数的预后或预测价值的必要性。
章节节选
样本选择与研究设计
这些犬淋巴瘤的细胞学涂片是从波尔图大学医学与生物医学科学学院细胞学与血液学服务部门的档案中回顾性收集的。犬淋巴瘤的诊断由一名拥有20年经验的病理学家完成（MS）。在研究中，每例病例的所有涂片都由一名观察者（FS）进行审核，最终选择细胞数量最多且保存状况最佳的涂片。这些样本的免疫表型此前已通过免疫标记技术确定
结果
本研究共纳入19例犬淋巴瘤病例：其中14例为B细胞型，4例为T细胞型，1例为无特异性淋巴瘤。在这些病例中，11例（58%）被诊断为大细胞淋巴瘤（8例B细胞型，2例T细胞型，1例无特异性淋巴瘤），7例（37%）被诊断为中细胞型淋巴瘤（5例B细胞型，2例T细胞型淋巴瘤），1例（5%）被诊断为B小细胞淋巴瘤。大多数病例（18/19；95%）起源于淋巴结，仅有1例（1/19；5%）起源于肠道肿块。研究对象中包括13只雄性犬（68%）和6只
讨论
已有研究表明，有丝分裂计数是多种犬类恶性肿瘤的独立预后因素[22,23]，而在犬淋巴瘤中，有丝分裂分级则是基于淋巴结活检的组织学切片来确定的[9]。研究显示，犬类低级别淋巴瘤的有丝分裂计数较低，而高级别淋巴瘤的有丝分裂计数则较高，这一现象反映了肿瘤的侵袭性[1,9]。不过，组织学切片中有丝分裂计数的评估结果往往因放大倍数不同而存在差异
结论
由于成本较低、易于获取且实用性强，细胞学仍是诊断和评估犬淋巴瘤的常用方法[5,27,37]，通过简单观察细针穿刺细胞学涂片就能获得大量信息。本研究的发现强调了需要采用更标准化的有丝分裂图像计数方法，以提高基于细胞学的分级系统的可靠性。如果能够实现标准化并经过验证，细胞学中的有丝分裂计数有望成为一种可靠且
利益冲突声明
作者声明在本次研究、文章撰写及发表过程中不存在任何利益冲突。
Filipe Sampaio|Carla Marrinhas|Ricardo Marcos|Mario Caniatti|Marta Santos
