辛多拉族（豆科蝶形花亚科）目标捕获系统发育学中同源基因识别方法的比较及其对物种树拓扑结构的影响

《Molecular Phylogenetics and Evolution》：Comparison of paralog identification methods and their impact on species tree topologies in target capture phylogenomics within the Sindora clade (Detarioideae: Leguminosae)

　　摘要：目标捕获是一种用于生成高通量DNA测序数据的方法，这类数据可用于重建物种间的系统发育关系，而单拷贝基因通常最具信息量。然而，目标捕获存在一个普遍问题，即那些被认为为单拷贝的基因实际上可能是由基因重复产生的同源基因，这对系统发育推断而言是个问题，因为它们的进化历史可能与物种的分化历史不同。在此，我们以豆科Detarioideae亚科88个物种的目标富集数据集为案例，重点研究Sindora支系，探讨处理同源基因的方法，包括HybPiper和CAPTUS中内置的同源基因处理功能，以及后续的“潜在同源基因检测”方法和基于树的Yang & Smith正交性推断方法。我们比较了这些方法标记出的同源基因，并通过BLAST比对Sindora glabra的参考基因组序列来验证其性能，随后比较了这些方法生成的物种树拓扑结构。通过对Sindora支系中标记出的同源基因的比较，我们发现“潜在同源基因检测”流程在识别同源基因方面最为准确，其结果与BLAST比对的相似度最高，其次是CAPTUS内置的同源基因识别功能。不过，对于Detarioideae亚科的研究结果表明，物种树拓扑结构的最大差异并非仅仅源于移除了已识别的同源基因序列，而是源于使用了经过同源基因过滤的对齐结果（如“潜在同源基因检测”流程和Yang & Smith正交性推断方法）。这一现象在HybPiper组装的数据集中存在，但在CAPTUS组装的数据集中则没有出现。在所有比较中，不同同源基因处理方法导致的拓扑结构差异往往局限于那些存在杂交和基因渗入等过程的支系中。我们的研究为在没有连续染色体参考基因组的条件下，确定识别、消除或分离同源基因的最佳方法提供了指导，并强调了除了了解同源基因的存在程度及其特征（如各拷贝之间的序列差异）之外，仔细检查和处理数据的重要性。

引言：同源基因是导致基因树冲突的诸多原因之一（Goodman等人，1979；Maddison，1997；Galtier和Daubin，2008），这类冲突会干扰从DNA序列数据中准确重建系统发育关系。同源基因是指由基因重复产生的同源基因（Fitch，1970），而正交基因则是通过物种形成产生的同源基因（Fitch，1970）。导致同源基因形成的基因重复有两种类型：涉及整个基因组的整个基因组重复（WGD），以及包括串联、邻近、分散或转座重复在内的较小规模的基因重复事件（Qiao等人，2019）。同源基因在开花植物中十分常见，因为在被子植物的进化史上，所有植物科都记录有WGD事件（Cui等人，2006；Jiao等人，2012；Jiao等人，2011；Ren等人，2018；One Thousand Plant Transcriptomes Initiative，2019）。如果比较的是物种间的同源基因而非正交基因，那么重建系统发育关系就会面临困难，因为同源基因的进化历史可能与物种的进化历史并不相同（Bailey等人，2003；Galtier和Daubin，2008）。同源基因及其不同的进化历史会给系统发育信号带来噪声，这也会影响后续的分析，如分化时间估计、生物地理学重建以及性状进化的比较研究。

许多系统发育研究采用混合捕获（目标捕获）作为一种低代表度基因组测序方法，该方法利用来自一个或多个参考基因组或转录组中选定的所谓单拷贝基因来生成“诱饵集”，用以“捕获”研究群体中的目标基因（Weitemier等人，2014）。在选定并测序这些基因后，会使用如HybPiper（https://github.com/mossmatters/HybPiper）（Johnson等人，2016）或CAPTUS（Raza等人，2023）之类的流程来组装目标序列。然而，很难确保所有被测序的分类群中的基因都是单拷贝的，因为诱饵是根据参考分类群中推断出的单拷贝状态来选择的，但由于其他基因或基因组重复事件，其他分类群中的基因状态可能有所不同（Johnson等人，2016）。因此，HybPiper和CAPTUS的组装流程都包含后续步骤来识别并消除潜在的同源基因。还有其他几种用于处理同源基因的后续流程，其中包括专为与HybPiper输出结果配合使用的“潜在同源基因检测”流程（Zhou等人，2022）。另一种是“目标富集正交性流程”（以下简称Yang & Smith流程；https://bitbucket.org/dfmoralesb/target_enrichment_orthology/src/master/）（Yang和Smith，2014；Morales-Briones等人，2022），该流程旨在通过基于系统发育树的分析来分离同源基因。

处理同源基因的各种方法可分为两大类，即基于相似性的方法和基于树的方法（Morales-Briones等人，2022）。基于相似性的方法是根据基因与所研究基因已知拷贝的序列一致性来识别潜在的同源基因，这些方法包括HybPiper和CAPTUS内置的同源基因标记功能，以及针对HybPiper组装结果的“潜在同源基因检测”（PPD）流程（Zhou等人，2021）。在HybPiper中，首先通过BLAST进行基于参考序列的读段提取（Altschul等人，1990），然后使用SPAdes进行从头组装（Bankevich等人，2012；Prjibelski等人，2020），从而为每个基因生成组装序列。随后，“paralog_retriever”命令会识别出那些获得多个序列且长度足够长（至少为参考序列长度的75%）的基因。其中长度最长的拷贝被认定为主要拷贝，如果各序列长度相同，则与参考序列相似度最高的序列被认定为主要拷贝，其余的则被列为同源基因（Johnson等人，2016；Johnson和Jackson，2025）。在完全基于从头组装的CAPTUS流程（https://github.com/edgardomortiz/Captus）中，首先使用MEGAHIT进行序列组装（Li等人，2015），然后通过BLAT根据序列与参考序列的相似度将序列分配到相应的基因上（Kent，2002）。如果同一个基因被分配了多个序列，它们会根据与参考序列的相似度和覆盖度进行排序，通常情况下会保留前五个同源基因，并将其与最佳匹配的序列（即主要拷贝）进行对齐，不过实际上用于构建系统发育树的一般只有主要拷贝（Ortiz等人，2023）。

“潜在同源基因检测”（PPD）流程（Zhou等人，2022）是通过将读段映射到HybPiper组装的序列上，从而识别出存在歧义（或杂合性）的序列。如果足够多的分类群共享相同的杂合位点，那么该基因就会被标记为潜在的同源基因，因为这种变异不太可能是等位基因差异所致，此时还可以进一步去除对齐结果中包含同源基因读段的区域。在所有这些基于HybPiper、CAPTUS和PPD的基于相似性的方法中都存在一些缺陷。这些方法都假设未被标记为同源基因的基因都是单拷贝且为正交基因，但实际上可能并非如此，因为可能存在隐匿的正交性，即多拷贝基因中只存在一个拷贝（Frost等人，2024）。隐匿的正交性可能由数据处理过程中的问题造成，如测序深度不足或目标捕获未能恢复所有拷贝，也可能由生物学过程导致，比如伪正交性，即基因重复后的差异性丢失使得不同物种中仅存在一个但非正交的基因拷贝（Frost等人，2024）。此外，所有这些方法都可能将实际上属于等位基因变异的基因错误地标记为同源基因。

像Yang & Smith流程（Yang和Smith，2014；Morales-Briones等人，2022）这样的基于树的方法则利用系统发育学方法来推断同源基因和正交基因（Gabaldon，2008）。Yang & Smith流程同时采用了“单系外群”（MO）和“有根外群”（RT）两种方法（Yang & Smith，2014）。MO方法会生成一棵去除了重复分类群（即同源基因）的树，而RT方法则保留所有的独立同源基因树，这样就可以同时还原出这些重复基因拷贝的进化历史（Morales-Briones等人，2022）。基于树的方法可以通过在预处理阶段去除特定谱系的重复序列，从而区分重复基因拷贝中的等位基因变异和真正的同源基因，但这些方法依赖于HybPiper和CAPTUS之类的序列组装流程，因为这些流程才为系统发育分析提供输入序列。

已有研究试图比较不同的同源基因识别方法（Frost等人，2024），并了解同源基因对系统发育推断的影响。虽然有些研究发现，纳入同源基因对系统发育重建的影响很小（Smith和Hahn，2022；Smith和Hahn，2021），但也有一些研究发现，同源基因可能会对物种树拓扑结构和支持度值产生负面影响（Brown和Thomson，2016；Frost等人，2024）。我们在现有关于同源基因如何影响系统发育推断的理解基础上，评估了基于相似性的同源基因检测方法的性能，这些方法包括HybPiper的“paralog_retriever”功能、CAPTUS内置的同源基因识别流程，以及针对HybPiper组装序列的“潜在同源基因检测”流程，然后将这些方法与利用染色体参考基因组来可靠识别同源基因的方法进行比较。之后，我们分析了基于相似性和基于树的方法（Yang & Smith的MO和RT方法）在处理同源基因时对基于共祖模型和串联模型的物种树的影响。

我们以豆科Fabaceae、Leguminosae亚科Detarioideae族的Sindora支系为研究对象，测试了不同的同源基因识别流程。Detarioideae族是较早分化的豆科亚科之一，包含81个属约760种物种（de la Estrella等人，2018）。Sindora支系属于Detarieae族，该族包含21个属，其中11个属仅分布于非洲，2个属为马达加斯加特有，2个属仅分布于亚洲，还有2个属仅见于新热带地区（de la Estrella等人，2018）。Sindora支系由五个亲缘关系密切的属组成，分别是Sindora、Copaifera、Tessmannia、Sindoropsis和Detarium。Sindora属有20种物种，其中19种分布于热带和亚热带亚洲，1种分布于西热带非洲（De Wit，1949；Promprom等人，2018）。Copaifera属是广布于全热带地区的属，共有39种物种，其中34种分布于南美洲，4种分布于非洲，1种分布于东南亚的婆罗洲（POWO，2025）。Tessmannia属、Sindoropsis属和Detarium属仅分布于非洲，它们分别有24种物种（van der Burgt和Breteler，2025）、1种物种和3种物种（POWO，2025）。最近对该类群进行的系统发育研究表明，Sindora支系内的属间关系尚未得到明确解析（de la Estrella等人，2018）。

我们通过基于目标捕获的研究来评估同源基因识别方法的性能，研究对象为Sindora支系，所使用的诱饵集是基于四种Detarioid豆科植物——Anthonotha fragrans、Afzelia bella、Copaifera officinalis和Prioria balsamifera的转录组序列设计的（Ojeda等人，2019）。对于这四种转录组，首先通过聚类建立蛋白质序列的正交性，然后再去除那些存在多个拷贝的蛋白质序列。剩余的蛋白质序列则通过系统发育学方法进一步检测其正交性（Ojeda等人，2019）。由于作为诱饵的这些基因在其他物种中的正交性状态可能与所用的四种参考转录组不同，所以我们利用现有的Sindora glabra参考基因组来验证Sindora支系各样本中基因的同源基因状态（Yu等人，2022）。Sindora支系是开展此类研究的理想对象，因为豆科在其进化史上经历了多次WGD事件（Cannon等人，2015；Koenen等人，2021），而且Detarioideae亚科的所有成员还共同经历了一次较近期的WGD事件（Zhao等人，2021）。尽管诱饵集是为Detarioideae亚科设计的，但我们预计在整个Sindora支系的各个物种中，二倍体化或局部重复现象会导致许多目标位点的拷贝数出现差异。

除了比较被标记出的同源基因外，我们还比较了不同同源基因处理方法生成的物种树拓扑结构。我们的目标是提供对目标捕获数据集中处理同源基因的方法及其对后续树结构影响的必要比较评估，以便在缺乏先验基因组知识的研究中选择合适的分析流程。样本选择、DNA提取、目标捕获与测序共对88个样本进行了测序，其中包括87个来自Detarioideae亚科的样本，以及1个来自亲缘关系较近的Dialioideae亚科的Cercis canadensis样本，后者被用作外群。由于使用基于合并法的系统发育推断软件ASTRAL即可生成准确的物种树，因此每个物种只需采集一个样本，无需为每个物种采集多个个体（Zhang等人，2018；Rabiee等人，2019）。在87个Detarioideae亚科样本中，有25个来自Sindora属。

HybPiper与CAPTUS的序列恢复情况总结HybPiper在所有位点和所有样本中共恢复了24,229个基因，比CAPTUS在其默认数据集中恢复的21,915个基因多出2,314个基因（表2，补充图1-2）。不过，尽管恢复的基因数量较少，CAPTUS在比对结果中往往能识别出更多具有变异性和简约信息的位点（表2）。

HybPiper与CAPTUS流程恢复的同源基因数量比较HybPiper共识别出71个同源基因（图3）。而在CAPTUS中，有286个基因在至少一个样本中被发现存在同源基因。

不同方法标记出的同源基因对比我们利用Sindora glabra参考基因组（Yu等人，2022）来验证所研究基因的同源状态，并以此为基础比较其他基于相似性的同源基因检测方法。我们认为这种参考基因组方法是目前最客观且可重复的评估标准，但不同物种的同源状态可能与该参考基因组存在差异，尤其是那些与参考基因组进化距离较远的物种，或者那些同源基因……

结论在这项以Detarioideae亚科豆类为研究对象的研究中，在没有参考基因组的情况下，识别同源基因的最佳方法是PPD。不过，该方法目前仅适用于通过HybPiper组装的序列，且需要根据研究群体的分类范围调整优化参数。其次较为准确的方法是CAPTUS的默认同源基因识别功能，它恢复的同源基因数量多于HybPiper。PPD以及CAPTUS的默认功能……

CRediT作者贡献声明Le Min Choo：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，可视化，软件，方法学，研究，数据整理，概念设计。Manuel de la Estrella：数据整理，研究，方法学，资源提供，监督，写作——审稿与编辑。Rowan J. Schley：写作——审稿与编辑，监督，软件，方法学。Richard K. Tennant：写作——审稿与编辑，监督，软件，资源提供。Félix Forest：写作——审稿与编辑，监督。

未引用的参考文献Priyam等人，2019年。

利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢L.M.C.的科研经费来自新加坡国家发展部通过新加坡国家公园局（NParks，NParks的花园城市基金）提供的研究生奖学金。R.J.S.的经费来自自然环境研究委员会的标准资助项目（资助编号NE/V012258/1）。M.d.l.E.最初获得欧盟玛丽·居里计划的资助（资助协议编号659152），之后又得到西班牙科学创新部的支持……

Le Min Choo|Manuel de la Estrella|Rowan J. Schley|Richard K. Tennant|Félix Forest|Catherine A. Kidner|R. Toby Pennington英国德文郡埃克塞特市北公园路拉弗大楼，埃克塞特大学地理系，邮编EX4 4QE