小胶质细胞CX3CR1信号介导退行性颈椎病中的突触修剪

《Neurobiology of Disease》：Microglial CX3CR1 signaling mediates synaptic pruning in degenerative cervical myelopathy

　　

退行性颈椎病（DCM）包含多种导致颈椎管压迫的疾病。尽管压迫诱导的神经退行性变的病理生物学机制尚未完全阐明，但由CX3CR1驱动的小胶质细胞突触修剪被认为是主要贡献因素。本研究基于先前的工作，该工作表明Cx3cr1^-/-小鼠在DCM后表现出步态改善，并旨在确定CX3CR1介导的突触修剪是否是这种改善的基础。研究人员比较了C57BL/6（WT，野生型）和Cx3cr1^-/-小鼠在12周DCM期间的表现。分别使用CatWalk和Von Frey结果指标评估运动功能和疼痛功能。在基线和DCM后4周，使用突触前和突触后标志物、运动诱发电位（MEPs）和全细胞膜片钳记录来表征突触和电生理变化。Cx3cr1^-/-和WT小鼠在基线时表现出步态差异。所有组的归一化显示，Cx3cr1^-/-小鼠在12周内表现出改善的运动功能，并在Von Frey测试中表现出更高的机械敏感性。DCM诱导后4周，Cx3cr1^-/-小鼠的小胶质细胞在背角和腹角中显示出对兴奋性和抑制性突触的吞噬减少。这伴随着背角兴奋-抑制（E/I）平衡的破坏，主要由抑制性传递的丧失驱动（通过全细胞膜片钳记录确认），以及皮质脊髓-神经肌肉兴奋性的改变（通过运动诱发电位确认）。总之，研究人员的发现揭示了CX3CR1介导的小胶质细胞突触修剪是早期DCM病理生物学的一个潜在新贡献因素。具体而言，研究结果表明，缺乏修剪会改变背角的突触E/I平衡，这可能是Cx3cr1^-/-小鼠观察到的步态改善的基础。

**研究背景、问题与意义**
退行性颈椎病（DCM）是一类由颈椎管压迫导致脊髓损伤的年龄相关性疾病，常引起步态障碍、上肢麻木等神经功能缺损。尽管其发病率高且致残性强，但压迫诱导的神经退行性变机制尚不完全清楚，临床治疗手段有限。小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的关键免疫细胞，通过CX3CR1（趋化因子受体，CX3C趋化因子受体1）信号介导突触修剪，参与发育和疾病状态下的神经环路重塑。先前研究表明，Cx3cr1^-/-（CX3CR1基因敲除）小鼠在DCM后步态功能改善，但CX3CR1介导的突触修剪是否为此改善的机制基础尚不明确。本研究旨在探索早期（DCM后4周）CX3CR1介导的突触修剪对DCM病理过程的影响，为理解其机制和治疗靶点提供依据。论文发表在《Neurobiology of Disease》。

**主要技术方法**
研究人员使用雌性C57BL/6J（WT）和Cx3cr1^-/-小鼠（Jackson Laboratory，Krembil研究所饲养），通过植入聚芳醚材料诱导C5-C6水平DCM。主要技术包括：CatWalk步态分析（评估运动功能）、电子Von Frey纤维测试（评估机械痛敏）、免疫组织化学结合Imaris 3D重建（定量小胶质细胞对兴奋性/抑制性突触的吞噬）、运动诱发电位（MEPs）（记录皮质脊髓-神经肌肉通路兴奋性）、全细胞膜片钳记录（检测背角II层神经元自发兴奋性/抑制性突触后电流，sEPSCs/sIPSCs）。

**研究结果**
3.1. Cx3cr1^-/-小鼠在DCM期间表现出步态改变
通过CatWalk系统12周监测，主成分分析（PCA）显示Cx3cr1^-/-与WT小鼠在基线和DCM期间步态显著分离。归一化后，Cx3cr1^-/-小鼠平均速度、前肢/后肢体速度、摆动速度显著提高，站立时间和步态周期缩短，表明其维持更快、更协调的步态模式。

3.2. Cx3cr1^-/-小鼠在DCM后机械敏感性呈增加趋势
Von Frey测试显示，两种基因型小鼠的退缩阈值均随时间下降（p=0.0079），但Cx3cr1^-/-小鼠恢复轨迹更弱，基因型差异接近显著（p=0.0626），提示其疼痛反应增强，步态改善并非由痛觉整体降低引起。

3.3. DCM导致进行性脊髓萎缩和神经元丢失
组织学分析显示，两种基因型小鼠在DCM后2周和4周，损伤中心总横截面积显著减少，背角和腹角NeuN⁺神经元数量均随时间下降（背角：0-4周p=0.0301；腹角：2-4周p=0.0443），但基因型间无差异。

3.4. Cx3cr1^-/-小鼠在DCM后突触吞噬减少
通过3D共聚焦成像，Cx3cr1^-/-小鼠背角中CX3CR1⁺小胶质细胞数量显著少于WT（p=0.0019）。在背角和腹角，Cx3cr1^-/-小鼠小胶质细胞对兴奋性（VGLUT2⁺/Homer1⁺）和抑制性（VGAT⁺/Gephyrin⁺）突触的吞噬均显著减少（p<0.0001），表明CX3CR1信号对突触修剪至关重要。

3.5. CX3CR1敲除改变DCM后MEP的诱发阈值
MEP记录显示，DCM后4周，Cx3cr1^-/-小鼠MEP潜伏期缩短（p=0.0018）且刺激阈值降低（p=0.0496），而WT阈值升高。基线时Cx3cr1^-/-小鼠阈值已高于WT（p<0.0001），提示发育性差异。

3.6. CX3CR1敲除在DCM后4周改变背角兴奋-抑制平衡
全细胞膜片钳记录背角II层神经元，发现Cx3cr1^-/-小鼠在DCM后E/I频率比升高（p=0.0071），主要由抑制性突触后电流（IPSC）频率和振幅下降趋势驱动（p=0.0601, p=0.0836），且IPSC上升时间增加（p=0.0371）。兴奋性传递无显著变化，提示抑制性张力丧失是E/I失衡主因。

**讨论与结论**
讨论部分总结：研究发现Cx3cr1^-/-小鼠在DCM后步态改善，但痛觉敏感性增加；首次证明其小胶质细胞突触吞噬减少，伴随背角E/I失衡（抑制性降低）和MEP阈值降低。研究人员认为，背角抑制性张力丧失可能导致脊髓运动环路去抑制，从而改善步态。此外，CX3CR1还可能通过影响炎症和抗凋亡通路发挥作用。研究局限性包括仅观察4周电生理、未评估腹角单细胞、全身敲除导致发育性步态差异等。结论部分翻译：总之，本研究提供了证据表明，CX3CR1依赖的小胶质细胞突触修剪是早期DCM病理生物学的贡献因素，且背角突触E/I平衡的转变可能与Cx3cr1^-/-小鼠观察到的运动功能改善相关。这是首次在DCM背景下强调CX3CR1依赖的小胶质细胞突触修剪，为推动未来研究提供了基础。