《Neurobiology of Disease》：Sex-dependent protective effects of microglial tumor necrosis factor on post-stroke inflammation and myelin injury
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肿瘤坏死因子(TNF)在缺血性卒中后会快速诱发，但其在卒中后炎症中被提出的细胞特异性及性别依赖性功能仍未被充分阐明。本研究中，研究人员探讨了小胶质细胞来源的TNF在永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)的急性期和亚急性期反应中的作用。卒中后Tnf的表达呈一过性上调
肿瘤坏死因子(TNF)在缺血性卒中后会快速诱发，但其在卒中后炎症中被提出的细胞特异性及性别依赖性功能仍未被充分阐明。本研究中，研究人员探讨了小胶质细胞来源的TNF在永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)的急性期和亚急性期反应中的作用。卒中后Tnf的表达呈一过性上调，在4小时变得显著，于12至24小时达到峰值，并在5天时回落至基线水平。原位杂交证实了梗死区及梗死周围区有强烈的Tnf表达。全脑转录组谱分析显示，全局性TNF缺失重塑了缺血后的早期反应，使其从小胶质细胞相关的吞噬和伤口愈合途径转向干扰素相关的炎症特征。为了确定小胶质细胞TNF的特异性贡献，研究人员使用了可诱导的Cx3cr1CreER:Tnffl/fl小鼠。在小鼠中，小胶质细胞TNF缺失对pMCAO后24小时或5天的梗死体积没有影响，但在雌性小鼠中这两个时间点均显著增加了梗死面积。在两种性别中，脑内TNF水平在24小时达到峰值，并在Cx3cr1CreER:Tnffl/fl小鼠中显著降低，证实了小胶质细胞是缺血后早期TNF的主要来源。然而，下游后果因性别而异。在5天时，雄性Cx3cr1CreER:Tnffl/fl小鼠表现出小胶质细胞反应性降低和18 kDa转位子蛋白(TSPO)信号减弱，T细胞浸润没有变化，且成熟少突胶质细胞的密度增加。相反，雌性Cx3cr1CreER:Tnffl/fl小鼠表现出增强的小胶质细胞反应性、增加的TSPO结合、更高的梗死周围区T细胞浸润，以及降低的少突胶质细胞密度和髓鞘完整性。这些发现表明，小胶质细胞TNF是卒中后炎症和髓鞘损伤的性别依赖性调节因子。
缺血性卒中是全球范围内致死和导致长期神经残疾的主要原因。卒中后的恢复不仅受初期损伤影响，还受继发性反应尤其是神经炎症的深刻调控。作为细胞因子的重要来源与调节者，小胶质细胞的表型和功能高度多样化，这挑战了将卒中后炎症视为单一有害过程的传统观念。肿瘤坏死因子(TNF)作为脑缺血后诱导的核心细胞因子，其作用仍存争议，既可能驱动炎症与神经元损伤，也可能支持缺血预处理与组织修复，这种多效性取决于细胞来源、受体平衡等多种因素。在急性受损的大脑中，小胶质细胞是TNF的主要来源，但以往由于常规的髓系细胞敲除方法无法将常驻小胶质细胞与其他骨髓来源的巨噬细胞区分开来，小胶质细胞TNF的精确功能一直未被明确阐明。此外，生物学性别是卒中神经生物学中关键但尚未充分探索的变量，而小胶质细胞TNF在缺血性卒中中是否发挥性别特异性作用仍属未知。为了探究这一问题并填补现有研究空白，研究人员展开了本项研究，旨在探究小胶质细胞TNF在卒中急性与亚急性期的作用及其与性别、髓鞘重塑的关联。研究人员得出结论，小胶质细胞来源的TNF在卒中后发挥性别依赖性的保护作用，在雌性中限制梗死进展、保护髓鞘，而在雄性中则主要参与炎症重塑而非影响病灶体积。这一研究揭示了TNF在卒中后具有细胞来源特异性与性别特异性的双重复杂功能，指出针对TNF的治疗策略必须综合考虑细胞来源、受体环境与性别差异，具有极其重要的基础与转化医学意义。该论文发表在《Neurobiology of Disease》。
在技术方法方面，研究人员使用了7至8周龄的C57BL/6、全局TNF敲除及诱导型小胶质细胞特异性敲除小鼠队列，构建了永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)模型以再现持续性动脉闭塞的缺血性损伤。研究综合运用了定量聚合酶链反应(qPCR)、RNA测序与转录组学分析、原位杂交、蛋白质印迹法、免疫荧光染色及配体放射自显影技术，并结合握力、热痛觉与转棒等行为学评估手段，对卒中后脑组织的基因表达、蛋白改变、细胞表型及功能预后进行了系统分析。
在研究结果部分，研究人员发现：
Tumor necrosis factor is rapidly and transiently induced after permanent middle cerebral artery occlusion in male mice：通过qPCR和原位杂交研究得出，雄性小鼠在pMCAO后脑内Tnf表达呈现迅速且短暂的诱导特征，在4小时显著上调，12至24小时达到峰值，5天后回落至基线，且信号集中于梗死区及梗死周围区。
Global TNF deficiency alters the early transcriptional response to ischemic stroke in male mice：通过全脑转录组测序与生物信息学分析得出，全局性TNF缺失重塑了雄性小鼠卒中后早期的转录应答。在野生型小鼠中，应答富含小胶质细胞相关吞噬及伤口愈合途径；在全局TNF敲除小鼠中，则发生转变，呈现干扰素相关和炎症小体相关的炎症特征富集。
Microglial TNF exerts a sex-dependent protective effect on infarct development after ischemic stroke：通过甲苯胺蓝染色评估梗死体积得出，小胶质细胞特异性TNF缺失对雌雄小鼠具有截然不同的影响。在雄性小鼠中，该缺失未引起24小时或5天的梗死体积变化；但在雌性小鼠中，24小时和5天的梗死体积均显著增加，病灶分布更广，证明小胶质细胞TNF在雌性中发挥限制病灶进展的急性与亚急性保护作用。
Microglial TNF deletion has a limited impact on functional outcome after stroke：通过行为学测试发现，小胶质细胞TNF缺失对卒中后早期功能预后的影响极为有限，仅在雄性小鼠中观察到握力有小幅但显著的增加，雌雄小鼠在感觉与运动协调上均无明显差异。
Microglial TNF deletion differentially affects ERK activation in males and females after stroke：通过蛋白质印迹法得出小胶质细胞TNF差异性调控卒中后早期ERK通路活化。在雄性中，该缺失降低了基线状态的ERK磷酸化但在缺血后3小时增加其磷酸化；而在雌性中，该缺失并未引起显著的ERK活化调节变化。
Microglial TNF deletion is associated with distinct downstream inflammatory changes in males and females：通过电化学发光分析细胞因子得出，小胶质细胞TNF缺失均显著降低了雌雄小鼠卒中后早期脑内TNF水平。但在雄性中代偿性地升高了趋化因子CXCL1，而在雌性中则引起了5天时肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的进一步上调，表明不同性别具有截然不同的下游炎症适应机制。
Microglial TNF deletion drives opposite microglial reactivity and inflammatory profiles in males and females at 5 days after stroke：通过基因表达分析、免疫荧光与放射自显影得出，至卒中后5天，雄性小鼠的小胶质细胞反应性降低、TSPO结合信号减弱且T细胞浸润未变；而雌性小鼠则表现出Iba1+CD68+反应性小胶质细胞比例升高、TSPO信号增强及梗死周围区CD3+ T细胞浸润加剧。
Microglial TNF deletion has opposite sex-dependent effects on oligodendrocyte density and myelin integrity after stroke：通过免疫荧光评估少突胶质细胞与髓鞘状态得出，雄性小鼠脑内成熟少突胶质细胞密度显著增加且伴随髓鞘碱性蛋白(MBP)面积分数升高的趋势；而雌性小鼠的少突胶质细胞密度则显著降低，MBP面积分数下降，表明髓鞘完整性受损。
在讨论与结论部分，研究人员总结指出，小胶质细胞TNF是卒中后缺血性炎症与组织重塑的性别依赖性调节因子。在小鼠中，小胶质细胞TNF缺失未影响梗死大小但表现出小胶质细胞反应性降低及少突胶质细胞指标改善；而在雌性中，该缺失使得卒中后早期原本短暂迅速诱导的TNF缺失后，促炎状态失去控制，加重了梗死进展、亚急性期炎症反应、T细胞浸润加剧，并导致少突胶质细胞和髓鞘的完整性丧失。基于以上结果，本研究认为TNF在卒中后不应被单纯视为有害环境的标记物或一种均一的促炎驱动因素，而是作为早期适应性反应的重要部分发挥保护功能，尤其在雌性机体中帮助维持一个受控的、支持修复的炎症微环境。研究结论中进一步提出，由于TNF的功能取决于其细胞来源、分子形式、受体通路及性别的下游信号识别，因此应以细胞靶向、受体感知及性别告知的原则来重新审视和优化未来的靶向TNF脑缺血治疗策略。
