《New Biotechnology》：An integrated automated pipeline for cloning, transient expression, and purification augmenting the plant cell pack platform for biopharmaceutical screening
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摘要翻译：生物制药，特别是单克隆抗体（mAbs），是一类快速扩张的治疗药物，并受益于用于蛋白质工程的高通量筛选（HTS）策略。从植物中获取此类复杂的生物制药可能具有优势，因为瞬时表达可以在一周内产生克级产物。为了实现高通量筛选，该系统被缩小为植物细胞包（PCP
摘要翻译：生物制药，特别是单克隆抗体（mAbs），是一类快速扩张的治疗药物，并受益于用于蛋白质工程的高通量筛选（HTS）策略。从植物中获取此类复杂的生物制药可能具有优势，因为瞬时表达可以在一周内产生克级产物。为了实现高通量筛选，该系统被缩小为植物细胞包（PCP）技术，采用微量滴定板格式，并在液体处理工作站上实现自动化，但该技术受限于手动克隆和蛋白质纯化。因此，研究人员首先构建了一个模块化载体文库，包含15种pTRAc骨架构建体，它们在调控基因表达和蛋白质靶向元件方面有所不同，可通过限制性连接克隆实现任何靶基因的快速整合。在此基础上，研究人员开发了一种自动化的无缝克隆工作流程，用于瞬时表达之前，并整合了基于磁珠的下游纯化流程，用于单链可变区片段（scFv）单克隆抗体。该自动化工作流程可在单个平台上，于9天内同时完成多达375个蛋白质变体的顺序克隆、表达和纯化，每个变体有10个PCP重复。相比之下，在相同时间内，手动处理仅能处理15个变体（10个重复），通量提高了25倍，同时成本降低了30%，每个变体的成本从79欧元降至61欧元。以针对急性髓系白血病、基于抗CD64 H22 scFv的重组免疫毒素为案例研究，获得了63%的回收率和>95%的纯度，适用于体外测定。因此，将研究人员克隆和纯化工作流程整合到PCP平台中，建立了一条自动化流水线，加速了早期生物制药开发。
研究背景与问题：生物制药，尤其是单克隆抗体（mAbs），是增长最快的药物类别，但其开发依赖高通量筛选（HTS）技术进行蛋白质工程优化。植物瞬时表达系统因其能在短期内产生克级蛋白质而成为有潜力的替代平台。植物细胞包（PCP）技术已被自动化到微量滴定板格式，并整合到液体处理工作站（LHS）上，实现了每天4800个样本的表达与分析通量。然而，该自动化平台仍存在两个关键瓶颈：上游的分子克隆和下游的蛋白质纯化步骤均依赖手动操作，这严重限制了整个筛选流程的实际通量，使得理论上的高通量无法实现。此外，现有的pTRAc载体系统缺乏模块化，难以快速组合不同的调控元件和靶向信号，限制了表达条件的快速优化。因此，本研究的核心问题是如何将分子克隆和蛋白质纯化整合到现有的自动化PCP平台中，以建立从基因到纯化蛋白质的完整自动化流水线。
研究内容与结论：针对上述问题，研究人员开展了一项系统性研究，旨在开发并验证一个集成的自动化流水线，以增强PCP平台用于生物制药筛选。首先，研究人员构建了一个包含15种pTRAc骨架的模块化载体文库，这些骨架在启动子/5‘非翻译区（UTR）组合（CHS、omega、TL）、N端信号肽（靶向胞质、质体、质外体）和C端信号（靶向内质网、液泡）方面存在差异，从而允许目标基因通过限制性连接快速克隆到不同表达 cassette 中。基于此，研究人员在LHS上开发并验证了一个自动化的单因子克隆工作流程，该流程包括PCR扩增、磁珠纯化、限制性酶切、连接和后连接消化，实现了96%的克隆效率，与手动方法相当，但通量从每天15-20个克隆提升至384个。对于需要融合两个编码序列的双因子克隆，其效率较低（约22%），因此研究人员决定采用更现代的基因合成技术替代。随后，研究人员开发了一种基于96孔板、使用4°C热循环仪冷却的农杆菌（A. tumefaciens）转化方法，该方法无需液氮或电穿孔设备，可在LHS上实现自动化，尽管转化效率（约61 CFU/μg DNA）低于传统方法，但结合后续的克隆验证，仍具实用性。通过有限稀释法分离单克隆的尝试因残留DNA导致PCR假阳性而失败，因此单克隆分离步骤仍需手动进行。在下游纯化方面，研究人员建立并自动化了一个基于蛋白L偶联磁珠的纯化流程，用于从PCP粗提物中直接纯化含scFv的免疫毒素。该流程在96孔板格式下，对mCherry-H22模型重组免疫毒素（RIT）实现了63%的回收率和超过95%的纯度，且未检测到宿主细胞蛋白污染，表明单步纯化足以满足体外细胞培养实验的要求。最后，成本分析显示，自动化平台处理每个蛋白质变体的总成本为61欧元，比手动流程的79欧元降低了30%。考虑到设备投资，自动化平台在筛选约15,000个候选蛋白质后，相较于手动流程在经济上更具优势，在90%和50%的利用率下，分别约在86周和155周达到盈亏平衡点。
关键技术与方法：研究人员在开展这项研究时，主要采用了以下几项关键技术方法：1）模块化载体文库构建：通过PCR扩增和限制性连接或Gibson组装，系统性地组合了不同的启动子/5‘UTR（CHS、omega、TL）、信号肽（LPH、rbcS）和C端靶向/纯化标签（SEKDEL、DLLVDTM、His6），生成了15种用于不同亚细胞区室靶向的pTRAc表达载体。2）自动化克隆工作流程：在Hamilton Microlab VANTAGE液体处理站上，实现了PCR产物磁珠纯化、限制性酶切、连接及后连接消化的自动化，以96孔板格式进行，单日可处理384个克隆反应。3）自动化农杆菌转化：开发了基于4°C热循环仪冷却的化学转化法，替代了传统液氮冷冻或电穿孔法，使其可在LHS上自动化操作。4）自动化磁珠纯化：采用蛋白L偶联磁珠，在96孔板格式下，直接从PCP粗提物中纯化含scFv的靶蛋白，流程包括结合、洗涤和洗脱步骤，全部在LHS上自动化执行。5）定量分析与成本建模：使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色结合光密度测定法进行蛋白质定量和纯度评估，并基于设备投资、耗材、劳动力和通量等参数，对自动化和手动流程的成本进行了比较分析。
研究结果与讨论：
1. 生成pTRAc系统模块化载体文库：研究人员通过组合3种5’UTR（CHS、omega、TL）、N端信号肽（LPH、rbcS）和C端靶向信号（SEKDEL、DLLVDTM），构建了15种pTRAc载体，可分别将重组蛋白靶向至胞质、质体、内质网（ER）、液泡和质外体。该文库支持通过NcoI/NotI位点快速替换目标基因，并通过AscI/EcoRI、EcoRI/NcoI、NotI/XhoI等位点灵活更换其他表达元件，为后续自动化流程奠定了基础。
2. 开发自动化pTRAc载体组装工作流程：研究人员将手动克隆流程的四个主要步骤（插入片段制备、载体消化、片段连接、转化）适配到液体处理站（LHS）上。在插入片段纯化步骤中，比较了96孔柱式纯化、超滤膜和磁珠三种方法，最终选择磁珠法，因其无需离心机且可并行处理多板，尽管DNA回收率约64%，但通量最高。在载体骨架与插入片段分离步骤中，引入了后连接消化策略，利用模型蛋白IL-6编码序列中的ApaI内部限制性位点，在连接后消化未正确组装的载体，从而将步骤简化为5步。通过单因子克隆验证，优化的插入片段与载体比例（30:1）和磁珠纯化流程在LHS上实现了96%±4%的克隆效率，与手动方法无显著差异。然而，双因子克隆（融合两个编码序列）的效率显著较低（约22%），因此研究人员建议采用基因合成技术替代模块化结构域改组。
3. 开发自动化农杆菌单克隆菌株生成流程：研究人员比较了电穿孔、液氮冷冻、干冰/乙醇、NaCl/冰、冰浴和热循环仪冷却等多种转化方法。热循环仪冷却法（4°C）虽转化效率（约3.1×103 CFU/μg DNA）低于电穿孔和液氮法，但可在LHS上直接操作，且克隆效率较低有助于后续单克隆筛选。然而，使用连接混合物而非纯化质粒时，转化效率显著下降98%，阳性克隆比例降至约81%。有限稀释法虽理论上可实现单克隆分离，但因残留载体DNA导致PCR假阳性，无法保证单克隆性，因此该步骤仍依赖手动菌落挑取，未来计划整合自动菌落挑取仪。
4. 开发PCP表达蛋白的自动化纯化步骤：研究人员将基于蛋白L偶联磁珠的纯化流程从1.5 mL试管规模成功缩小至96孔板规模，并将样本体积从400 μL降至150 μL，回收率保持稳定（约65-69%）。该流程可直接处理PCP粗提物，无需预先澄清或浓缩，回收率与缓冲液体系相当。在LHS上自动化后，对mCherry-H22模型RIT实现了63%±14.6%的回收率，纯度超过95%，未检测到宿主细胞蛋白污染。该自动化纯化流程单板处理时间为60分钟，可并行处理8块板（768个样本），日通量达6144个样本，超过了PCP平台每日4800个样本的生成和分析能力。此外，蛋白A偶联磁珠对IgG1单克隆抗体贝伐珠单抗也显示出类似效率，表明该流程具有通用性。
5. 自动化PCP平台成本分析：研究人员基于每日375个载体组装、375个农杆菌培养和3750个PCP样本（每个构建体10个重复）的假设，对自动化与手动流程的全流程成本进行了比较。自动化流程中，上游克隆成本为18欧元/构建体，PCP表达与解析成本为27欧元/构建体，下游纯化成本为16欧元/构建体，总计61欧元/构建体。手动流程相应成本分别为23欧元、39欧元和17欧元，总计79欧元/构建体，比自动化流程高30%。设备投资方面，自动化平台需350,000欧元，而手动流程仅需18,000欧元。基于这些参数，自动化平台在筛选约15,000个候选蛋白质后经济上更优，在90%和50%利用率下，分别约需86周和155周达到盈亏平衡点。
讨论与结论：本研究成功地将上游分子克隆和下游蛋白质纯化整合到自动化的PCP平台中，形成了一个从基因到纯化蛋白质的完整流水线，显著提高了生物制药筛选的通量（从15个变体提升至375个变体，25倍）并降低了成本（30%）。该平台的核心优势在于其模块化设计，不仅允许快速更换目标基因，还支持系统性地优化表达调控元件（如启动子、5’UTR、信号肽）和靶向区室，从而加速蛋白质工程和表达条件的筛选。研究结论指出，尽管自动化流程已覆盖大部分步骤，但仍有少数环节（如转化后琼脂板培养、单克隆分离、BY-2细胞转移和PCP培养）需要手动干预，未来计划通过整合自动菌落挑取仪和外部培养箱来实现完全自动化。此外，本研究的纯化模块特异性地依赖于蛋白L和蛋白A与抗体（scFv和mAb）的结合特性，对于其他类型的生物制药（如酶、疫苗），需要开发替代的亲和纯化基质。该项研究发表于《New Biotechnology》，其意义在于为植物瞬时表达系统在生物制药早期开发中的应用提供了一个完整、高效、可扩展的自动化解决方案，有望加速候选药物的筛选和优化进程。
