《Journal of Comparative Neurology》：The Connections of the Telencephalic Pallium in the White Sturgeon, Acipenser transmontanus: An Experimental Study
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鲟鱼是古老且基干的辐鳍鱼类（ray-finned fishes）类群，其形态对于理解组成辐鳍鱼类辐射主体的硬骨鱼类（teleosts）的进化至关重要。在鲟鱼中，外套（pallium）或背侧区（area dorsalis）由外侧、内侧和后侧三个分区组成。研究人员
鲟鱼是古老且基干的辐鳍鱼类（ray-finned fishes）类群，其形态对于理解组成辐鳍鱼类辐射主体的硬骨鱼类（teleosts）的进化至关重要。在鲟鱼中，外套（pallium）或背侧区（area dorsalis）由外侧、内侧和后侧三个分区组成。研究人员通过注射生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine, BDA）和DiI确定了这些外套分区的连接。所有三个分区均接收嗅觉输入，其中后侧分区接收了大部分次级嗅觉投射（secondary olfactory projections）。所有三个外套分区也拥有广泛的端脑内连接（intratelencephalic connections），以及来自丘脑（thalamus）和后结节（posterior tubercle）的输入。后侧分区还接收来自中脑（midbrain）和峡部次级味觉核（secondary gustatory nucleus of the isthmus, sGN）的稀疏输入。所有三个外套分区显著投射至同侧下叶（ipsilateral inferior lobe）的下丘脑（hypothalamus），并较为稀疏地投射至同侧视顶盖（optic tectum）、后结节和中脑被盖（midbrain tegmentum）。细胞学和连接数据均未提供鲟鱼中存在背侧或中央外套分区的证据，这些分区很可能在祖先硬骨鱼类中才出现。
**论文解读：白鲟端脑外套的连接与进化意义**
**研究背景与问题**
辐鳍鱼类（Actinopterygii）是脊椎动物中最大的辐射类群，其脑部结构复杂多样。鲟鱼（Acipenseriformes）作为辐鳍鱼类的基干类群，其形态对于理解硬骨鱼类（teleosts）的进化至关重要。端脑外套（telencephalic pallium）在辐鳍鱼类中由于外翻（eversion）过程而呈现独特的拓扑结构，导致其分区同源性长期存在争议。早期研究基于Nieuwenhuys（1962）的命名法，将鲟鱼外套分为背侧区（area dorsalis）的中央区（Dc）、内侧区（Dm）、背侧区（Dd）和外侧区（Dl）。然而，后续研究在Dm的吻尾范围、Dp的边界界定以及Dc是否存在等问题上出现分歧：Northcutt和Braford（1980）提出“限制性Dm假说”，认为Dm仅局限于端脑半球吻侧；Huesa等（2006）则主张“扩展性Dm假说”，认为Dm延伸至整个吻尾长度。此外，关于Dp的边界，前者基于次级嗅觉投射分布，后者基于强乙酰胆碱酯酶（AChE）阳性神经元。最关键的是，是否存在独立的Dc仍存疑问：在硬骨鱼中Dc具有独特的室管膜起源并投射至视顶盖（optic tectum），但鲟鱼中被称为Dc的细胞群可能仅是Dl、Dm甚至Dp的迁移细胞，且不投射至视顶盖。因此，亟需通过实验性束路追踪研究明确白鲟（Acipenser transmontanus）各外套分区的纤维连接，以解决这些争论，并为辐鳍鱼类外套进化提供证据。
**研究概述与结论**
研究人员对63只幼年白鲟（体长20–30 cm，购自Sterling Sea Farms，加州萨克拉门托）进行单侧注射生物素化葡聚糖胺（BDA, 10,000 MW）或DiI，分别注入外套的外侧区（Dl）、内侧区（Dm）、中央区（Dc）、后侧区（Dp）、下叶（inferior lobe）和视顶盖等部位。通过顺行和逆行标记追踪纤维连接，并结合细胞构筑特征，得出以下结论：白鲟外套仅由外侧、内侧和后侧三个分区组成，所有分区均接收来自嗅球（olfactory bulb）的输入（后侧分区接收最密集的次级嗅觉投射），并具有广泛的端脑内连接以及来自丘脑（thalamus）和后结节（posterior tubercle）的输入。三个分区均显著投射至同侧下叶的下丘脑，并稀疏投射至视顶盖、后结节和中脑被盖。细胞学和连接数据均不支持鲟鱼中存在背侧区（Dd）或中央区（Dc），这些分区可能是硬骨鱼类的衍征（apomorphy）。该论文发表在《Journal of Comparative Neurology》。
**关键技术方法**
研究人员主要采用神经束路追踪技术：对63只幼年白鲟（来源：Sterling Sea Farms）进行BDA（10,000 MW）或DiI的单侧脑内注射，分别靶向Dl（N=5）、Dm（N=6）、Dp（N=4）、Dc（N=2）、视顶盖（N=6）及下叶（N=6）等区域。BDA注射后存活8天，经灌注固定、冷冻切片（40 μm）后采用Vectostain ABC试剂盒显色，中性红复染；DiI注射后置于40–42°C孵育21–40天，振动切片（50 μm），用n-phenylenediamine复染。通过荧光显微镜（Olympus BH-2）观察并利用相机 lucida 绘制投射图谱。此外，还对比了长吻雀鳝（Lepisosteus osseus）、弓鳍鱼（Amia calva）和幼年神仙鱼（Astronotus ocellatus）的视顶盖注射结果。
**研究结果**
**3.1 Dl连接**：BDA注入Dl后，逆行标记了同侧嗅球的僧帽细胞（mitral cells）和内部细胞层细胞、球后核（retrobulbar nucleus）、所有吻侧次皮层核团、同侧Dm和Dp以及丘脑隆起（thalamic eminence）和腹内侧丘脑核（ventromedial thalamic nucleus）。顺行纤维投射至同侧Vn（腹侧区“nother”核）和其余次皮层核团，少量纤维经前连合至对侧Vd、Dm、Dl和Dp。下行纤维终止于同侧缰核、浅顶盖前核、前肾小球核（prelomerular nucleus）、后结节内侧核（MPT）以及下叶的侧部和尾部室周下丘脑，并稀疏投射至同侧视顶盖。
**3.2 Dm连接**：BDA注入Dm后，逆行标记了同侧嗅球僧帽细胞、球后核、所有次皮层核团、Vs、Vp、EN、Dl和Dp大量细胞，以及背侧丘脑核、中央后丘脑核和后结节内侧核及室周下丘脑腹侧部。顺行投射至同侧嗅球内部细胞层和球后核、所有次皮层核团，少量纤维经前连合至对侧半球。下行纤维分为外侧束（终止于下叶腹侧部室周下丘脑核和尾侧室周下丘脑）和内侧束（终止于缰核、双侧后结节内侧核，并稀疏至同侧视顶盖和中脑被盖）。
**3.3 Dc连接**：BDA或DiI注入被识别为Dc的区域后，逆行标记了同侧嗅球僧帽细胞、Dm、Dp、Vn、Vd、Vv、Vs、Vp、前/后室旁小细胞视前核、丘脑隆起、腹内侧丘脑核、后结节室周核和前肾小球核。顺行纤维投射至覆盖的Dl、Dm、Dp，以及嗅球内部细胞层和球后核。此外，标记纤维经前连合至对侧外侧嗅束（这些纤维很可能是被注射点中断的次级嗅觉投射）。下行纤维终止于缰核、前肾小球核和后结节内侧核。值得注意的是，与硬骨鱼不同，未观察到Dc纤维投射至视顶盖；对侧视顶盖的DiI逆行注射显示，白鲟中投射至视顶盖的外套神经元位于Dc背侧，而非Dc本身。
**3.4 Dp连接**：BDA注入Dp后，逆行标记了大量嗅球僧帽细胞和内部细胞层细胞、球后核、同侧Vl、Dl、双侧Vv、所有次皮层核团、腹内侧丘脑核、后结节室周核、前肾小球核、室周下丘脑各部、后结节内侧核，以及中脑被盖和峡部次级味觉核（sGN）中的大型神经元。顺行投射密集至同侧嗅球内部细胞层和球后核、Vd和Vl，其余次皮层核团也有稀疏输入。下行纤维分为内侧通路（终止于缰核、视顶盖和前肾小球核）和外侧通路（密集终止于外侧丘脑核、后结节内侧核和室周下丘脑各部，未终止于外侧丘脑核的纤维经内侧前脑束延续至中脑被盖和sGN）。
**3.5 下叶上行连接**：DiI注入下叶（主要涉及室周下丘脑外侧部）后，逆行标记了同侧Dl、Dm、Dp、Vp、尾侧次皮层核团，以及背侧丘脑的背后核和中央后核。顺行投射至所有向该区域发送传入的端脑中枢，并投射至同侧嗅球内部细胞层。
**讨论与结论**
讨论部分指出，白鲟外套连接与西伯利亚鲟（Acipenser baeri）的研究（Huesa等, 2006）基本一致，分歧主要源于分区边界解释不同。研究人员提出，鲟鱼的Vn并非与多鳍鱼（Polypterus）的Vn同源，而应视为腹侧区背侧核的背侧亚区（Vd-d）。基于细胞构筑和连接数据，白鲟中不存在类似硬骨鱼的Dd（因Dd特征性的密集小圆形神经元在Dl中不存在）和Dc（因Dc无纤维包膜，且不投射至视顶盖或半环圆隆）。Dm在鲟鱼中仅限于端脑半球吻侧半（限制性假说），证据包括：Dm区域具有酪氨酸羟化酶阳性细胞和亮氨酸-脑啡肽阳性神经毡；若Dm延伸至尾侧，则应在室管膜表面下方出现约250微米宽的次级嗅觉投射稀疏带，但实际未观察到；Dm传出纤维投射至下叶浅层，而Dp传出纤维投射至下叶深层，若Dm覆盖Dp则BDA注射应标记整个下叶神经毡，但实际仅标记深层。Dp的边界应由次级嗅觉投射的密集分布决定，而非AChE阳性神经元。
结论部分（翻译）：白鲟端脑的外套（背侧区）由外侧、内侧和后侧三个分区组成。所有三个分区均接收嗅球输入，其中后侧分区接收最密集的输入。所有三个外套分区也拥有广泛的端脑内连接，以及来自同侧丘脑和后结节的输入。所有三个分区均显著投射至后结节和中脑被盖，并稀疏投射至视顶盖。在鲟鱼或其他非硬骨鱼辐鳍鱼类中没有证据表明存在背侧（Dd）或中央（Dc）分区，这些分区必然在硬骨鱼类中才出现。从系统发育背景来看，外套模块化（pallial modularity）存在于最早的辐鳍鱼类中，并在辐鳍鱼类进化中变得更加复杂和明确，其中Dl-Dc-视顶盖模块在硬骨鱼类中产生。这些结论应通过检查我们知之甚少的全骨鱼类（holostean fishes）的外套组织来支持。
