摘要
福尔马林固定石蜡包埋组织为转化研究提供了丰富的样本资源，这些样本具有临床相关结果。然而，福尔马林导致的蛋白质交联会阻碍蛋白质的有效提取，进而限制其在蛋白质组学中的应用。我们使用保存了30多年的肝细胞癌组织，系统比较了三种蛋白质提取方法：采用Covaris缓冲液的自适应聚焦声波法（AFA/Covaris-b）、采用SDS缓冲液的AFA法（AFA/SDS-b），以及基于SDS的裂解后再经SP3处理和消化的方法（SP3/SDS-b）。我们在两个肝细胞癌病例的三个连续肿瘤切片上进行了对比分析，随后使用ZenoTOF 7600+质谱仪通过数据独立采集技术对蛋白质进行定量分析。所有方法均检测到了5206种蛋白质，平均识别数量相近（AFA/Covaris-b：4068种；AFA/SDS-b：4134种；SP3/SDS-b：4048种），但重复性存在差异（变异系数分别为11.9%、12.2%和20.8%），因此排除了SP3法。在包括配对肿瘤组织及相邻非肿瘤组织的八个肝细胞癌病例中，共检测到6018种蛋白质，其中AFA/Covaris-b法的平均识别数为3876种，AFA/SDS-b法为3852种。两种AFA法都具有较高的重复性，其中AFA/Covaris-b法的变异系数更低（肝细胞癌组织为13.5%，非肿瘤肝脏组织为11.0%），而AFA/SDS-b法的变异系数分别为肝细胞癌组织14.8%，非肿瘤肝脏组织11.3%。虽然不同方法检测到的上调通路并不一致，但下调通路的检测结果在各种方法间更为一致。由于缺乏适当的时间对照或新鲜冷冻对照，这些结果需谨慎解读。总体而言，基于AFA的方法能够实现对长期保存的FFPE组织进行重复性高的蛋白质组分析，为回顾性蛋白质组学研究中的方法评估提供了实用方案。
研究的意义
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FFPE组织是全球范围内最具价值的带有临床注释的生物样本资源之一。但由于蛋白质的广泛交联，尤其是在长期保存的样本中，这类样本在蛋白质组学研究中的应用受到限制。我们的研究通过系统评估和验证针对保存超过30年的FFPE肝细胞癌组织的蛋白质提取策略，解决了这一难题。通过直接对比基于AFA法和SP3法的结果，我们发现采用Covaris缓冲液的AFA方案在保持较高蛋白质组覆盖度的同时，具有更优异的重复性。重要的是，我们发现这些长期保存的样本中可检测到6000多种可定量的蛋白质，且不同方法检测到的蛋白质通路模式具有重复性，不过由于缺乏适当的对照以及可能存在提取相关的偏差，这些生物学信号的解读仍存在局限。这些结果表明，长期保存的FFPE样本可作为现代数据独立采集质谱技术的有用资源。从几十年前的FFPE组织中获取重复性高的蛋白质组信息具有重要意义，它有助于回顾性发现生物标志物、将蛋白质组数据与基因组数据整合，以及在具有丰富注释的患者群体中验证治疗靶点。本研究通过提供可重复的蛋白质提取方法，为更广泛地利用长期保存的FFPE组织奠定了基础，也有助于未来开展大规模、纵向的癌症蛋白质组学研究。
利益冲突声明
作者声明不存在任何利益冲突。
数据可用性说明
蛋白质组学相关的质谱数据已通过jPOST合作存储库上传至ProteomeXchange联盟，对应的数据集标识分别为ProteomeXchange平台为JPST004153/PXD070191，jPOST平台为JPST004155/PXD070497。用于同行评审的审稿人访问链接及密码（网址和访问密钥）已包含在论文中。并非所有的中间分析文件（如DIA-NN处理后的输出文件）都已被上传，但用于重现主要研究结果的关键数据均已提供。由于投稿系统对文件大小有限制，补充表S3、S4、S8和S9对应的完整数据集，包括DIA-NN处理后的输出文件（pg_matrix.tsv和pr_matrix.tsv），会在同行评审期间作为可供审稿人访问的文件提供，同时也会被上传至jPOST存储库。补充表S12–S14对应的处理后的补充数据集则被上传至Zenodo平台（https://doi.org/10.5281/zenodo.20221164）。审稿人可通过同行评审期间提供的私人预览链接访问这些数据。补充表S15总结了用于定量分析的处理后的蛋白质组数据文件的相关信息。
