《Reproduction in Domestic Animals》：Methodological Determinants of Grayscale Pixel Intensity in Ram Testicular Ultrasonography: Effects of ROI Placement and Imaging Plane Across Age Groups and Two Reproductive Periods
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睾丸超声检查在公羊繁殖适应性评估中应用日益广泛，但定量灰度图像分析的方法学标准化仍较有限。本研究主要目标是在固定超声采集方案下，确定感兴趣区域（ROI）放置与成像平面对Güney Karaman公羊睾丸实质数值像素值（NPV）的影响。次要目标为比较不同年龄组及
睾丸超声检查在公羊繁殖适应性评估中应用日益广泛，但定量灰度图像分析的方法学标准化仍较有限。本研究主要目标是在固定超声采集方案下，确定感兴趣区域（ROI）放置与成像平面对Güney Karaman公羊睾丸实质数值像素值（NPV）的影响。次要目标为比较不同年龄组及两个预定义繁殖期采样点（8月与3月）间NPV差异。29只健康、已证有生育力的公羊分为三组：1.5岁（n=8）、3.1岁（n=12）、4.6岁（n=9）。繁殖期（8月）与非繁殖期（3月）使用7.5-MHz线阵探头行B型超声检查。每侧睾丸分析10个标准化ROI（纵向6个、横断4个，纵隔上、下各半）。ImageJ分析共得1160个斑点测量值。采用含动物与睾丸ID随机截距的线性混合模型处理重复测量层级结构。结果显示NPV随年龄升高；8月高于3月（71.65±1.75 vs 60.89±1.75，p<0.001）；纵隔下显著高于纵隔上（89.50±1.75 vs 43.03±1.75，p<0.001）；横断图像高于纵向（68.61±1.77 vs 63.93±1.74，p<0.001）。随机效应分析表明个体间、睾丸间、斑点水平变异分别占总方差31%、7%、62%。上述发现证明公羊睾丸回声强度受生物与方法学因素共同影响，亟需标准化多点采样方案。
研究背景方面，繁殖性能是羊群盈利的核心参数，公羊贡献约半数群体繁殖潜力，繁殖适应性检查（BSE）涵盖解剖、体况、睾丸测量与精液评价等。B型超声作为无创工具已用于估计睾丸体积与评估实质回声纹理，计算机辅助图像分析将灰度像素强度（0–255）称为数值像素值（NPV）。尽管既往研究提示NPV与曲细精管微观结构、组织成分相关，但ROI选取策略（如纵隔上/下、纵/横平面、单区或多点）尚未统一，导致不同研究间NPV与精液质量关联结果不一致。年龄与繁殖期（光周期调控）可改变睾丸生理，但ROI位置与平面对NPV的方法学贡献量化不足。因此研究人员在固定机型与增益参数下，系统评估ROI相对于睾丸纵隔（mediastinum testis）的位置及成像平面对NPV的影响，并比较年龄组与8月（繁殖期）、3月（非繁殖期）差异。该研究发表于《Reproduction in Domestic Animals》，为绵羊睾丸超声定量化提供方法学基线。
关键技术方法上，研究人员在土耳其Konya的Bahri Da?da?国际农业研究所选取29只单胎出生、体重45–55 kg、已证生育的Güney Karaman公羊，按8月实足年龄分1.5岁（n=8）、3.1岁（n=12）、4.6岁（n=9）三组，于8月与隔6月的3月各检一次。使用Mindray DP-50 VET配7.5-MHz线阵探头，单人操作，范围、对比、总增益、近远增益、焦距（4 cm）全程恒定。每睾丸采最大截面纵、横静帧，ImageJ 1.48v用spot meter在实质内部（避开纵隔与伪影）布10个约1 cm2斑点（纵面6：纵隔上3下3；横面4：纵隔上2下2）。每只公羊每期20斑点，两期共1160测量。统计采用IBM SPSS 23拟合线性混合模型（LMM），固定效应为年龄组、季节、ROI（纵隔上/下）、平面（纵/横）及AgeGroup×Season、AgeGroup×ROI、Season×ROI、AgeGroup×Season×ROI，随机截距为Animal ID与嵌套其内的Testis ID，方差成分结构，REML估计，Bonferroni校正事后比较。
研究结果部分，按原文小节浓缩如下。
3.1 描述性统计：繁殖期各年龄组均值随龄升高（Group1 60.50、Group2 69.98、Group3 83.05），非繁殖期Group1（59.67）略高于Group2（55.91）但低于Group3（65.69）；整体繁殖期71.42±1.31高于非繁殖期59.98±1.08。
3.2 线性混合模型结果：Type III检验中AgeGroup（F2,26=6.17, p=0.006）、Season（p<0.001）、ROI（F1,1092=4203.49, p<0.001）、Plane（p<0.001）主效应均显著；AgeGroup×Season、AgeGroup×ROI、Season×ROI及三者交互均显著（p≤0.018）。
3.3 估计边际均值：年龄组Group3最高（74.84±3.03），Group1与Group2无差异（60.55、63.42）；繁殖期71.65±1.75＞非繁殖期60.89±1.75；纵隔下89.50±1.75＞纵隔上43.03±1.75；横断68.61±1.77＞纵向63.93±1.74。AgeGroup×Season中Group3繁殖期83.52最高、Group2非繁殖期56.38最低。AgeGroup×ROI显示纵隔下NPV随龄上升（80.99→87.32→100.20），纵隔上各龄相近（40.11–49.48）。Season×ROI显示繁殖期纵隔下/上差（97.69 vs 45.61）大于非繁殖期（81.32 vs 40.46）。三者交互峰值在Group3繁殖期纵隔下（112.94±3.23），谷值在Group2非繁殖期纵隔上（35.41±2.79）。
3.4 随机效应与模型拟合：动物ID方差71.34（ICC 0.308，占30.8%），睾丸ID嵌套方差15.45（占6.7%），残差144.72（占62.5%）。表明同一睾丸内斑点水平异质性是NPV变异主要来源。
讨论部分总结：研究人员指出NPV受年龄、繁殖期等生物因素与ROI位置、平面等方法学因素共同塑造，其中纵隔上/下差异约46.5单位，远大于年龄（Group3比Group1高约14.3）与季节（约10.8）效应，平面差约4.7单位。ROI以纵隔为解剖地标而非灰度内参，因纵隔本身随龄变厚变亮，故绝对NPV比纵隔比值更适当前后比较，但多中心需进一步验证。年龄升高NPV与Santa Inês羔羊观察一致，但Dorper公羊呈反向，说明品种与协议限制推广。8月高于3月与Awassi公羊季节变化同向，但纬度/光周期/温度可改向。平面差异源于声束-组织交互而非机设变化。残差62.5%印证实质本身异质，单ROI不足以代表全睾，必须多斑点采样。作者承认缺同步精液、激素、多普勒与组化验证，且仅两时间点非全年轨迹，焦距固定可能引入深度相关偏移。结论译文：在固定采集条件下，公羊睾丸实质NPV受相对于纵隔的采样位置强烈影响，受成像平面次之，并随年龄组与8月/3月检查期变化。因仅评两采样点，该发现不描述睾丸回声全年轨迹；ROI位置、成像平面、焦点位置与采样期必须在跨动物或跨研究比较NPV前显式标准化与报告。虽未验证NPV为生育力标志物，但证明其对ROI放置与平面高度敏感，该方法学洞见应纳入未来公羊睾丸超声研究。未来标准化协议应将焦区置于解剖地标（优选纵隔处或其稍下方），并报告焦距、增益与ROI深度。
