《Talanta》：Dual-modal immunoassay for prostate cancer-derived exosomes enabled by a black phosphorus/silver SERS substrate and Yb/Er co-doped NaGdF
4 UCL nanoprobes
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摘要外泌体被视为临床生物检测中用于癌症早期诊断和预后的相关生物标志物。然而，如何实现对外泌体的超灵敏定量检测仍是一项挑战。本研究开发了一种基于表面增强拉曼散射和上转换发光的双模式免疫检测方法，用于检测前列腺癌来源的外泌体。通过将黑磷与银纳米颗粒结合，构建出一种具有优异性能的SER
摘要
外泌体被视为临床生物检测中用于癌症早期诊断和预后的相关生物标志物。然而，如何实现对外泌体的超灵敏定量检测仍是一项挑战。本研究开发了一种基于表面增强拉曼散射和上转换发光的双模式免疫检测方法，用于检测前列腺癌来源的外泌体。通过将黑磷与银纳米颗粒结合，构建出一种具有优异性能的SERS活性免疫底物，由于电磁效应与化学效应的协同作用，该底物的增强因子可达3.69×109。同时，利用掺杂镱和铒的NaGdF4纳米颗粒所产生的稳定且易于观察的绿色荧光，设计出了相应的免疫探针。通过三明治免疫结构中的抗原-抗体结合机制，可实现对外泌体的特异性捕获，借助这两种检测模式，检测下限分别可低至93和172个颗粒/毫升。此外，通过观察不同强度的绿色荧光，即可简单区分不同来源的外泌体，为前列腺癌的初步快速识别提供了可能。最后，通过对临床血清样本的验证，表明该方法在癌症的快速筛查与诊断方面具有巨大潜力。
引言
前列腺癌是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈上升趋势[1]、[2]。除了应用广泛的前列腺特异性抗原外，其他潜在的生物标志物如癌症相关外泌体也日益受到临床诊断领域的重视[3]。外泌体存在于血液、尿液及前列腺液等多种体液中，因其非侵入性或微创采样优势，非常适合用于动态监测[4]。先前的研究表明，前列腺癌细胞的活动性显著高于正常细胞，这使得癌症患者的前列腺液中外泌体水平明显升高[5]、[6]。因此，与癌症严重程度密切相关的较高外泌体浓度，已被用作一些常规检测方法中的诊断指标，这类方法包括酶联免疫吸附试验和西方印迹分析[7]、[8]。尽管这些方法在生物医学研究领域取得了重要进展，比如成功识别了多种癌症相关外泌体，但在某些方面仍有提升空间[9]。例如，这些方法在分析过程中难以实现高灵敏度和便捷性，这限制了其在临床检测中的广泛应用[10]、[11]。因此，亟需开发出一种功能多样的技术，以满足对微量生物标志物进行便捷高效现场检测的需求，从而拓展外泌体在临床中的应用前景。
近年来，双模式监测技术已成为生物医学诊断领域的一种有效策略[12]、[13]、[14]、[15]。其中，表面增强拉曼散射与荧光结合的生物传感器因其出色的灵敏度和多重检测及成像能力而备受关注[16]、[17]。不过，这类双模式传感器的实际应用受到了诸多固有问题的制约。首要问题在于，传统的有机荧光染料在激光激发下容易产生活性氧，可能对目标生物标志物造成不可逆的损害[18]、[19]。同时，在复杂的生物环境中，较高的背景荧光噪声也会显著降低SERS的灵敏度[20]、[21]。为了提升其在临床应用中的实用性，亟需开发出一种新型且稳定的多功能传感器，能够在生物环境中实现超灵敏的SERS检测以及便捷的荧光成像。
基于镧系元素的上转换发光技术可以通过双光子动态过程，将近红外光激发转化为可见光荧光[22]、[23]、[24]。例如，掺杂镱和铒的UCL纳米颗粒在近红外光（980纳米）激发下会发出绿色荧光（522纳米和541纳米），从而便于直观地观察其成像效果[25]。这类纳米颗粒因其近红外激发特性，非常适合用于生物医学领域，因为这种特性能有效避免紫外线-可见光照射时通常产生的活性氧风险[26]、[27]。此外，与传统荧光染料相比，这类纳米颗粒在SERS检测过程中的背景噪声更低，这是因为它们具有较低的背景自发辐射强度[28]。因此，近年来人们通过构建兼具SERS和UCL功能的复合纳米材料，开发出了用于早期肿瘤筛查的创新性成像引导策略[29]。虽然这种方法结合了可见光荧光标记与超灵敏的SERS底物，但如何在空间结构设计上优化两种技术的性能，以实现对外泌体的有效监测，仍是一个关键难题[30]。因此，有必要基于SERS-UCL双模式平台，开发出更高效的恶性肿瘤临床诊断方法。
本研究通过一种创新的双模式三明治免疫结构，实现了对前列腺癌相关外泌体的超灵敏检测与直观识别。该结构是通过合理组合黑磷/银纳米颗粒构成的SERS活性免疫底物，以及掺杂镱和铒的NaGdF4纳米颗粒构成的UCL免疫探针而形成的。实际上，黑磷/银混合底物具有强大的电磁和化学增强能力，其增强因子可达3.69×109。同时，由于掺杂稀土离子所引发的双光子效应，NaGdF4纳米颗粒能够产生明亮且稳定的绿色荧光。通过进一步利用抗原-抗体结合机制完善三明治免疫结构，借助SERS和UCL两种检测模式，分别实现了93和172个颗粒/毫升的较低检测下限，从而能够有效监测微量外泌体。值得注意的是，如此理想的检测下限得益于两种纳米材料在空间上的分离，这种分离既减少了SERS光谱中的荧光背景干扰，又避免了因空间“热点”导致的荧光淬灭现象。此外，被目标外泌体包裹的免疫结构在980纳米光激发下会表现出明显的宏观荧光，这使得可通过视觉观察实现简单的定性分析，便于癌症的初步判断。总体而言，所提出的双模式方法在高效开展前列腺癌早期诊断方面具有广阔的应用前景。
章节节选
材料与仪器
块状黑磷和N-甲基-2-吡咯烷酮由Macklin Biochemical Co., Ltd.提供，其纯度均不低于99.5%。所用稀土硝酸盐包括六水合三价钆硝酸盐、五水合三价镱硝酸盐和六水合三价铒硝酸盐，其纯度均不低于99.99%，此外还使用了柠檬酸钠、硝酸银、柠檬酸、聚偏二氟乙烯、氟化钠、辣根过氧化物酶等材料。
黑磷/银混合底物的表征与优化
为实现对前列腺癌相关外泌体的多模式监测，我们制备了黑磷/银混合SERS底物。首先，通过传统的冰浴研磨法将块状黑磷有效剥离成超薄纳米片。随后，将这些纳米片通过电泳沉积技术固定在铜箔上，从而形成均匀、平整且致密的黑磷薄膜，该薄膜具有极高的稳定性（见图S1）。之后，再加入银纳米颗粒。
结论
总之，本研究提出了一种全新的SERS-UCL双模式免疫检测平台，该平台结合了黑磷/银混合底物与掺杂镱和铒的NaGdF4纳米颗粒，可用于前列腺癌外泌体的早期免疫检测。由于电磁效应与化学效应的协同作用，黑磷/银底物展现了极高的SERS增强效率，其增强因子可达3.69×109。同时，NaGdF4纳米颗粒所产生的稳定且易于识别的上转换发光信号，能够与SERS检测相辅相成，进一步提升了检测的效率。
作者贡献说明
戴亚生：负责原文撰写、方法设计、实验研究、数据整理工作。赖长刚：参与实验研究工作。龚杰：参与实验研究工作。姚杰：负责原文撰写、方法设计、实验研究、资金申请以及数据整理工作。王世源：参与实验研究工作。吴科荣：负责原文审阅与编辑、项目指导以及资金申请工作。顾晨杰：负责原文审阅与编辑、项目管理、实验研究以及资金申请工作。江涛：负责原文审阅与编辑、项目管理工作。
致谢
本研究得到了以下机构的支持：中国国家自然科学基金（项目编号为62375146和62374097）、宁波大学的“优秀青年学者”力学交叉学科基金（项目编号为ZX2025000403）、宁波大学的“健康中国”交叉学科研究项目（项目编号为HY202405）、浙江省自然科学基金的联合资助项目（项目编号为LBZ24H80001），以及宁波市国际科技合作项目的资助。
戴亚生|姚杰|王世源|赖长刚|龚杰|顾晨杰|江涛|吴科荣
中国浙江省宁波市315010，宁波大学第一附属医院泌尿外科，泌尿学转化研究实验室
