NMB基因敲低对猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇生成的影响及机制

《Theriogenology》：Effects and mechanisms of NMB knockdown on cell proliferation, apoptosis and steroidogenesis in porcine ovarian granulosa cells

　　

摘要

神经肽B是一种神经肽，逐渐被认作是调控雌性生殖过程的潜在因子。然而，它在猪卵巢功能及卵泡发育中的作用仍不明确。鉴于卵泡颗粒细胞在卵泡生长、内分泌稳态以及卵子成熟过程中起着不可或缺的作用，本研究探讨了猪卵巢中NMB的表达模式，并研究了NMB基因敲除对颗粒细胞功能及其相关机制的影响。研究结果表明，NMB在猪卵泡的所有发育阶段（＜3毫米、3-5毫米、＞5毫米）均有表达，且其表达水平随卵泡直径增大而上升；此外，NMB主要在颗粒细胞中表达。功能实验进一步显示，NMB基因敲除会降低细胞存活率，抑制Cyclin B1和PCNA的表达；通过上调Bax和Caspase-3的表达同时下调Bcl-2的表达来诱导细胞凋亡；还会通过降低STAR、CYP11A1、HSD3B1和CYP19A1的表达来干扰E?和P?的合成。从机制上来看，NMB基因敲除会影响线粒体对Ca2?的摄取，并扰乱PKA/CREB信号通路，这体现在总PKA和磷酸化PKA以及CREB蛋白表达水平的下降上。重要的是，外源补充NMB可以缓解NMB基因敲除带来的功能缺陷。总体而言，这些发现表明NMB可能通过影响颗粒细胞中的线粒体Ca2?摄取以及PKA/CREB信号通路，发挥调控细胞存活率、细胞凋亡和类固醇合成的重要作用，从而为卵泡发育提供新的机制见解，也为提高猪的生殖效率提供了潜在靶点。

引言

卵巢是雌性哺乳动物的核心生殖器官，卵泡发育、排卵和黄体形成都在此发生。作为卵巢的基本功能单元，卵泡会经历周期性发育和萎缩，这些过程决定了卵巢的生殖内分泌功能[1]。在卵泡中，颗粒细胞是主要的机能性体细胞，它们通过合成类固醇激素——主要是雌二醇和孕酮——调节细胞增殖并产生细胞因子，从而维持卵泡微环境的平衡，促进卵泡的发育和成熟[2]。此外，颗粒细胞的增殖与凋亡之间的动态平衡对于卵巢的生理功能（如卵泡发育、卵子选择和成熟）至关重要[2]、[3]、[4]。这些过程的失衡会显著影响卵泡的命运，打破萎缩与排卵之间的平衡，进而降低物种的生殖效率[5]、[6]。颗粒细胞的增殖活性与细胞周期调控因子及增殖相关蛋白密切相关，包括增殖细胞核抗原和Cyclin B1[7]、[8]；而颗粒细胞的凋亡则与促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2以及执行凋亡功能的蛋白Caspase-3有关[9]、[10]。类固醇合成也是颗粒细胞的另一项重要功能，这一过程由多种关键因子调控，比如负责介导线粒体胆固醇转运的类固醇生成急性调节蛋白、催化胆固醇转化为孕烯醇酮的细胞色素P450 11亚家族A成员1、参与孕酮生物合成的羟基-δ-5-类固醇脱氢酶、3β-类固醇δ-异构酶1，以及编码芳香化酶、对雌二醇生成至关重要的细胞色素P450 19亚家族A成员1[11]。临床研究表明，芳香化酶缺乏或功能受阻会直接导致雌二醇合成异常，引发诸如发情周期紊乱、卵泡停滞和无排卵等生殖疾病[12]、[13]。因此，颗粒细胞的功能状态整合了增殖、凋亡和类固醇激素合成等功能，直接影响卵泡发育、卵子质量以及最终的生殖效率。

研究表明，除了在神经系统中的传统作用外，多种神经肽还能通过与相应受体结合，调节颗粒细胞的增殖以及雌二醇的合成与分泌，从而作为卵巢因子调控卵泡发育[14]、[15]、[16]。神经肽B属于bombesin相关肽家族，是G蛋白偶联受体家族中神经肽B受体的内源性配体，可参与多种生理功能，包括抑制进食、刺激胃肠道和泌尿生殖道平滑肌收缩、调节应激反应、调控多种激素的分泌以及影响肿瘤细胞的生长[17]、[18]、[19]。有研究显示，NMB在生殖轴中广泛分布，在生殖器官中表达水平很高[20]。此外，外源NMB能促进睾丸间质细胞中睾酮的合成与分泌，增强细胞增殖并抑制细胞凋亡，因此在男性生殖功能的调控中起着重要作用[21]、[22]。目前，提高母猪的生殖性能是研究重点，其中改善卵泡质量和排卵率是主要研究方向。不过，NMB在母猪卵泡发育及生殖激素合成等生理功能中的调控作用仍不清楚。

cAMP反应元件结合蛋白是一种在cAMP-蛋白激酶A信号通路中的关键下游效应蛋白，其转录活性主要受PKA介导的磷酸化作用调控[23]。CREB活化可促进类固醇生成相关基因的表达和细胞增殖[24]、[25]，而其去磷酸化则会诱导细胞凋亡[26]。值得注意的是，Ca2?是颗粒细胞功能中的重要第二信使，它能与cAMP依赖的信号通路协同作用，调节CREB的活性以及类固醇生成的转录过程[27]。线粒体对Ca2?的摄取还能将细胞内的Ca2?信号与线粒体代谢、ATP生成以及类固醇激素的合成联系起来，从而影响颗粒细胞的存活率和内分泌功能[28]、[29]。先前的研究表明，沉默与卵泡发育相关的因子G蛋白信号调节剂1，可能会通过抑制cAMP/PKA/CREB通路，增加大鼠颗粒细胞的凋亡并抑制其增殖[30]。不过，PKA/CREB信号通路调控猪卵泡发育的分子机制尚未完全明确，尤其是NMB是否在这一过程中起调控作用，还需要进一步研究。

为此，我们首先分析了猪卵巢组织及颗粒细胞中NMB的表达情况。通过siRNA介导的基因敲除技术，我们研究了NMB基因敲除对猪卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇合成的影响，同时还分析了相关的下游信号传导事件。此外，我们还通过外源补充NMB进行了挽救实验，以验证NMB的功能重要性，从而为卵泡发育和生殖内分泌功能的调控机制提供更多见解。

章节节选

材料

青霉素链霉素溶液（PS，ST488S，北京碧云天生物技术公司），SABC免疫组化染色试剂盒（SA1020，武汉博斯特公司），DAB染色剂（AR1022，武汉博斯特公司），DMEM/F-12（1:1）培养基（C11330500BT，北京吉博公司），胎牛血清（FBS，北京易尔贝奥公司），猪用NMB-10（纯度≥98%，编号1240513，上海GL生化有限公司），RNAiso Plus试剂（AJ60718A，北京泰卡拉公司），含gDNA去除功能的PrimeScript FAST RT试剂盒（RR092S，北京泰卡拉公司）。

猪卵巢中NMB的表达

为探究NMB在猪卵巢中的潜在作用，我们首先通过免疫组化技术分析了它的空间分布情况。结果显示，不同发育阶段的卵泡中均存在NMB的免疫反应性，且颗粒细胞中的染色强度高于卵巢的其他结构（见图1A、C和E）。放大图像进一步证实，NMB的染色主要集中于围绕卵子并位于卵泡壁上的颗粒细胞中，而卵巢的其他结构中染色相对较弱（见图）。

讨论

神经肽B属于bombesin相关肽家族，广泛分布于中枢神经系统以及胃肠道、生殖腺等外周组织和器官中[33]、[34]。此前的研究主要关注其在神经系统及胃肠道中的调控作用[17]、[35]、[36]、[37]，但它对生殖系统的影响，尤其是对卵泡发育的调控作用，目前仍了解不多。因此，本研究以母猪为研究对象。

结论

本研究系统地分析了NMB在猪卵巢颗粒细胞中的表达模式及其功能作用。结果显示，NMB在猪卵巢组织中广泛表达，主要存在于颗粒细胞中，且其表达水平随卵泡直径的增大而上升。功能缺失分析表明，NMB基因敲除会降低细胞存活率和增殖能力，促进细胞凋亡，同时通过降低STAR、CYP11A1、HSD3B1等关键类固醇生成因子的表达，抑制P?和E?的分泌。

CRediT作者贡献说明

李红霞：论文撰写——初稿撰写、结果验证、软件使用、方法设计、数据整理。 陈光振：结果验证、软件使用、方法设计、数据整理。 杨胜：论文撰写——审阅与编辑、方法设计。 刘琪：论文撰写——审阅与编辑、研究指导。 李佳：结果验证、软件使用、方法设计、数据整理。 王丹丹：结果验证、软件使用、方法设计、数据整理。 陈凤雷：论文撰写——审阅与编辑、研究指导。 马志宇：论文撰写——初稿撰写、结果验证、资源准备、项目统筹。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：31802149）、江苏省高校优势学科建设工程资助（项目编号：PAPD），以及“111计划”项目D18007的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本论文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

Hongxia Li|Guangzhen Chen|Jia Li|Dandan Wang|Sheng Yang|Qi Liu|Fenglei Chen|Zhiyu Ma

扬州大学兽医学院，中国扬州225009