在鸡颈静脉模型中，评估市售抗蛇毒血清针对锡兰环蛇和蓝环蛇毒液引发的神经毒性所具有的治疗窗口

《Toxicon》：Evaluation of the therapeutic window of commercial antivenoms against neurotoxicity induced by Bungarus ceylonicus and Bungarus caeruleus venoms in the chick-biventer cervicis model.

　　

摘要

眼镜蛇属（Bungarus）的毒液会导致渐进性神经肌肉麻痹。在斯里兰卡，由于没有针对当地特有的斯里兰卡眼镜蛇（Bungarus ceylonicus）毒液的特异性抗毒血清，人们不得不使用印度多价抗毒血清，尽管其效果并未得到充分证实。本研究利用鸡颈背肌神经-肌肉模型，探讨了印度商业抗毒血清（BHARAT、VINS）和澳大利亚多价抗毒血清（Seqirus）在暴露于斯里兰卡眼镜蛇及普通眼镜蛇毒液后，能够阻止神经毒性作用的时间窗口。实验中，毒液以不同浓度添加，以引发主要的前突触或后突触神经毒性，随后在毒液接触30分钟或90分钟后加入抗毒血清。结果显示，无论在何时加入抗毒血清，其对前突触神经毒性的抑制效果都会随时间下降：在30分钟后加入时只能部分抑制毒性，而90分钟后加入则完全无效。相比之下，后突触神经毒性在延迟后仍较易被中和——BHARAT抗毒血清在30分钟内可部分抑制两种眼镜蛇毒液的后突触效应，而VINS抗毒血清在同一时间点可完全抑制普通眼镜蛇的后突触神经毒性。这些发现支持这样一种假设：前突触毒素会迅速进入运动神经末梢，从而限制抗毒血清的作用及其逆转效果；而后突触毒素因作用于细胞外，其毒性效应则更易被逆转。

引言

蛇咬伤是一种被世界卫生组织认定的被忽视的热带疾病，高发地区为南亚、东南亚、撒哈拉以南非洲和拉丁美洲（Kasturiratne等，2008）。在亚洲具有医学重要性的蛇类中，眼镜蛇科（Elapidae）的Bungarus属物种危害极大，其毒液可引发致命的渐进性神经肌肉麻痹（Dixon & Harris，1999；Silva等，2016）。

眼镜蛇毒液中的神经毒素，尤其是β-眼镜蛇毒素，主要在前突触部位起作用，抑制神经肌肉接头的信号传递。这类磷脂酶A₂毒素会分解运动神经元中的磷脂，导致突触小泡耗尽和线粒体退化（Prasarnpun等，2005；Silva等，2017）。而后突触α-神经毒素则分为短链型（57–60个氨基酸残基，含4个二硫键）和长链型（66–74个氨基酸残基，含5个二硫键），属于三指毒素家族。这类毒素通过竞争性或伪不可逆地与神经肌肉接头后突触膜上的烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰神经肌肉信号的传递（Barber等，2013；Silva等，2017）。治疗蛇毒咬伤的主要方法是使用抗毒血清，这类血清含有针对特定蛇毒毒素的抗体（Silva等，2017）。抗毒血清的作用机制主要是通过抗体与毒液毒素表面的抗原表位结合，从而抑制其生物活性。当抗体结合干扰了毒素与其作用靶标或底物的相互作用时，即可实现直接的中和作用。不过，中和毒素活性并非抗毒血清发挥作用的唯一机制——抗体还可以通过空间阻碍、将毒素封存在血液循环系统内、加速毒素排出体外等方式，阻止毒素到达作用部位。综合来看，这些机制都能降低循环毒素的生物利用率，进而限制其造成的病理损害（Maduwage & Isbister，2014；Silva等，2017）。

全球范围内，斯里兰卡的蛇咬伤及中毒发生率位居前列（Ediriweera等，2016）。该国有两种已知的眼镜蛇物种：较为常见的是普通眼镜蛇（Bungarus caeruleus），栖息在斯里兰卡的干燥和中等湿度地区；而特有物种斯里兰卡眼镜蛇（Bungarus ceylonicus）则主要生活在该国的潮湿和中等湿度地带（Silva等，2023）。目前可用于治疗普通眼镜蛇中毒的特异性抗毒血清是印度多价抗毒血清，其中含有针对N. naja、B. caeruleus、D. russelii和毒液的抗体。但由于没有针对斯里兰卡眼镜蛇毒液的特异性抗毒血清，这类患者只能使用印度多价抗毒血清进行治疗（Rathnayaka等，2017；Kularatne等，2019）。此前，我们利用鸡颈背肌神经-肌肉模型，证明了斯里兰卡眼镜蛇和普通眼镜蛇的毒液均具有同等强度的前突触和后突触神经毒性（Galappaththige等，2025；Ginsborg & Warriner，1960）。在同一研究中，我们还检测了不同抗毒血清对这两种眼镜蛇毒液神经毒性的中和效果——BHARAT多价抗毒血清和澳大利亚多价抗毒血清能够交叉中和斯里兰卡眼镜蛇毒液的毒性，而BHARAT、VINS和澳大利亚多价抗毒血清则可交叉中和普通眼镜蛇毒液的毒性（Galappaththige等，2025）。不过，那项研究仅考察了在加入毒液之前预先加入抗毒血清的情况。而实际蛇咬伤发生后，抗毒血清需要在毒液进入体内数分钟到数小时后才能使用，此时任何已存在的前突触或后突触神经毒素很可能已经开始发挥作用。这样的时间差会影响抗毒血清预防神经肌肉麻痹的效果。因此，明确抗毒血清阻止或逆转神经肌肉接头中已存在神经毒素活性的“最佳时间窗口”至关重要。

本研究的目的是从机制层面确定，商业抗毒血清在鸡颈背肌神经-肌肉模型中，能够在多长的时间内阻止或逆转斯里兰卡眼镜蛇和普通眼镜蛇毒液的神经毒性。

章节节选

所用毒液与抗毒血清的相关信息

从多个野外捕获的斯里兰卡眼镜蛇和普通眼镜蛇个体中提取的冻干毒液，被溶解在50%甘油中，储存在-80℃条件下待用。所使用的多价抗毒血清为VINS（印度海得拉巴的Vins Bioproducts Limited公司生产，批次编号为01AS21073）和BHARAT（印度安伯纳斯的Bharat Serums and Vaccines公司生产，批次编号为A05322003），这两种抗毒血清均含有针对Naja naja、Daboia russelii、Bungarus caeruleus和的马源F(ab')₂免疫球蛋白片段——此外

斯里兰卡眼镜蛇毒液的前突触活性

在斯里兰卡眼镜蛇毒液（浓度为0.03 μg/mL）注入前5分钟加入浓度为10倍的BHARAT抗毒血清，可有效防止前突触神经毒性发生（见图1）。相反，若在毒液注入30分钟后才加入相同浓度的BHARAT抗毒血清，则只能部分抑制前突触神经毒性；而在毒液注入90分钟后加入该抗毒血清，则对前突触神经毒性没有任何显著抑制作用（见图1）。

斯里兰卡眼镜蛇毒液的后突触活性

在斯里兰卡眼镜蛇毒液（浓度为1 μg/mL）注入前5分钟加入浓度为1倍的BHARAT抗毒血清

讨论

我们测试了BHARAT和VINS印度多价抗毒血清以及澳大利亚多价抗毒血清，对斯里兰卡眼镜蛇和普通眼镜蛇毒液的前突触及后突触活性进行抑制的能力。在毒液注入前将抗毒血清加入实验体系时，所有抗毒血清都能有效中和这两种毒液的神经毒性。但若在毒液注入后再加入抗毒血清，三种抗毒血清的抑制能力都会随时间逐渐下降，且

结论

印度和澳大利亚的多价抗毒血清在抑制斯里兰卡眼镜蛇和普通眼镜蛇毒液的前突触活性方面，都会出现随时间逐渐减弱的趋势：在30分钟内还能部分抑制毒性，而90分钟后则完全无法发挥抑制作用，这一结果进一步支持了运动神经末梢损伤不可逆的现有假说。相比之下，这两种眼镜蛇毒液的后突触神经毒性在延迟后仍能被抗毒血清以不同的程度中和。本研究表明，所有受试抗毒血清

作者贡献说明

Wayne C. Hodgson：文章撰写——审阅与编辑、研究指导、概念设计。Jithmi Galappaththige：文章撰写——初稿撰写、数据可视化、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理。Anjana Silva：文章撰写——审阅与编辑、研究指导、资源协调、项目管理、方法设计、正式分析、数据整理、概念设计。Geoffrey K. Isbister：文章撰写——审阅与编辑、研究指导、概念设计。Kalana Maduwage：文章撰写——审阅与编辑、研究指导，

未引用参考文献

Silva等，2016。

伦理声明

所有动物实验均在斯里兰卡拉贾拉塔大学医学与相关科学学院伦理审查委员会的批准下进行（批准编号：ERC/2022/03）。

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

资金支持

本研究得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会的资助（项目编号为1110343和1154503）。同时，南亚临床毒理学研究合作组织也为本研究提供了后勤支持。

利益冲突声明

? 作者声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益或个人关系：Geoffrey K. Isbister表示自己获得了国家健康与医学研究委员会的财政资助。其他作者则声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢佩拉德尼亚大学的Indika Gawarammana赠送的毒液样本。同时，也要感谢斯里兰卡拉贾拉塔大学医学与相关科学学院寄生虫学系的Nimal Pathirana、MWPK Gamage、Sampath Hettiarachchi、Thilina Elpitiya和Rajitha Dissanayake在实验技术方面给予的帮助。

Jithmi Galappaththige|Wayne C. Hodgson|Kalana Maduwage|Geoffrey K. Isbister|Anjana Silva

斯里兰卡拉贾拉塔大学医学与相关科学学院寄生虫学系