《Nature Cell Biology》：CLOCK/BMAL1 interactome uncovers homeodomain factors as tissue regulators
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昼夜节律时钟通过协调全身基因表达和蛋白质功能的时间模式，构成生理学日常节律的基础。在哺乳动物中，这一系统的核心是CLOCK/BMAL1，一个广泛表达的异二聚体转录因子复合物，它协调组织特异性的昼夜节律基因表达。这种特异性的基础尚不清楚，但染色质上的组织特异性相
昼夜节律时钟通过协调全身基因表达和蛋白质功能的时间模式，构成生理学日常节律的基础。在哺乳动物中，这一系统的核心是CLOCK/BMAL1，一个广泛表达的异二聚体转录因子复合物，它协调组织特异性的昼夜节律基因表达。这种特异性的基础尚不清楚，但染色质上的组织特异性相互作用可能提供一种解释。在此，研究人员使用染色质免疫沉淀-质谱联用（ChIP-MS）技术，绘制了小鼠肝脏、肾脏和肺中CLOCK/BMAL1相关蛋白复合物在染色质上的图谱。研究人员检测到1,510种相关蛋白，其中大多数是组织特异性的，且不能由蛋白质丰度解释。在这些蛋白中，研究人员识别出同源异型域转录因子PROX1、HNF1B和HOXA5作为组织富集的相互作用因子，它们与BMAL1结合，共同占据大多数BMAL1基因组位点，并建立器官限制性的昼夜节律转录。研究人员的发现表明，组织特异性转录因子赋予核心时钟细胞身份，从而有助于器官特异性的节律性基因表达模式。
论文解读文章
昼夜节律是生物体内约24小时周期的内源性节律，调控生理和行为。在哺乳动物中，核心时钟由CLOCK/BMAL1异二聚体转录因子复合物驱动，该复合物广泛表达，但不同组织产生高度分化的节律转录输出，其分子机制尚不明确。此前研究表明，CLOCK/BMAL1的DNA结合强度与节律转录相关性较弱，提示仅靠DNA占据不足以解释组织特异性，可能依赖于组织特异性的染色质相互作用。为此，研究人员开展本研究，旨在系统性绘制CLOCK/BMAL1在体内的染色质互作组，识别组织特异性调节因子，从而揭示核心时钟如何整合时间与组织线索。
研究人员采用染色质免疫沉淀-质谱联用（ChIP-MS）技术，在转录活跃期多个时间点（ZT1、ZT4、ZT7、ZT10）对小鼠肝脏、肾脏和肺进行了系统分析。共识别出1,510个与CLOCK和BMAL1显著相互作用的蛋白质，其中约三分之二为组织特异性，且仅约20%的特异性互作因子可被核蛋白丰度差异解释，表明组织特异性互作并非由表达水平主导。进一步分析聚焦于三个同源异型域转录因子：PROX1（肝脏）、HNF1B（肾脏）和HOXA5（肺）。这些因子在各自组织中以时间依赖方式与BMAL1直接结合，共同占据80–90%的BMAL1基因组位点，包括核心时钟基因位点。功能实验显示，这些因子通过其同源异型域直接结合BMAL1的转录激活结构域（TAD），并抑制CLOCK/BMAL1的转录活性，类似于经典抑制因子CRY1。AlphaFold 3结构预测和点突变验证确认了BMAL1 TAD中E614和L619残基为关键界面。在细胞系中敲除Prox1或HNF1B后，核心时钟基因（如Cry1、Dbp、Nr1d1）的表达幅度显著增加，但相位不变；全球节律转录分析显示，约60%的振荡转录本在Prox1缺失后失去节律性，表明这些因子调节节律振幅而非时序。该研究发表在《Nature Cell Biology》。
技术方法方面，研究人员主要运用了以下关键方法：1) 染色质免疫沉淀-质谱（ChIP-MS）用于绘制体内蛋白互作组；2) 染色质免疫沉淀-测序（ChIP-seq）分析基因组共定位；3) RNA测序（RNA-seq）和实时定量PCR（RT-qPCR）评估基因表达和节律性；4) AlphaFold 3蛋白质结构预测；5) CRISPR-Cas9基因敲除进行功能验证。样本来源包括C57BL/6N小鼠组织（肝脏、肾脏、肺）和人类细胞系（HK-2、HEK293T）。
研究结果部分详细如下：
1. **时间维度肝脏CLOCK/BMAL1染色质图谱**：在ZT4、ZT7和ZT10三个时间点，共识别出756个互作蛋白，其中62%为单时间点特异，ZT7时间点互作蛋白数量最多（379个），与CLOCK/BMAL1染色质占据峰值一致。时间特异互作蛋白富集于不同功能，如ZT4富集核转运和蛋白修饰相关，ZT10富集泛素化相关。
2. **时空CLOCK/BMAL1互作组**：在三个组织中，共识别出1,510个互作蛋白，其中三分之二为组织特异性。组织特异性互作蛋白的富集分析显示，不同组织均富集节律过程和转录调控相关功能，提示组织特异性转录因子参与塑造节律输出。CLOCK/BMAL1蛋白水平在组织中一致，但互作组差异显著，表明组织特异性互作主要由染色质环境而非蛋白丰度决定。
3. **同源异型域转录因子的组织特异性互作**：通过反向ChIP-MS和共免疫沉淀（co-IP）实验，确认PROX1、HNF1B和HOXA5在肝脏、肾脏和肺中分别与BMAL1直接结合，且该互作依赖于BMAL1而非CLOCK。Benzonase处理不破坏互作，表明直接蛋白-蛋白接触。互作时间窗口限定在ZT1至ZT10，与CLOCK/BMAL1转录活跃期一致。
4. **BMAL1和同源异型域因子的基因组共定位**：ChIP-seq分析显示，肝脏和肾脏中BMAL1位点分别有89%和80%被PROX1或HNF1B共占据，且共占据位点富集节律相关基因。组织特异性共占据集中在核心时钟基因（如Cry1、Nr1d1）和器官功能基因，如肝脏脂质代谢和肾脏形态发生基因。
5. **同源异型域因子抑制CLOCK/BMAL1活性**：报告基因实验显示，PROX1、HNF1B和HOXA5剂量依赖性地抑制CLOCK/BMAL1对Per1启动子的转录激活。AlphaFold 3预测显示，这些因子的同源异型域与BMAL1的TAD和PAS核心形成类似界面。点突变（E614A/L619A）不影响物理互作但显著减弱抑制功能，同源异型域缺失则完全消除互作和抑制。
6. **同源异型域因子调节器官节律输出**：在dihXY小鼠肝细胞和HK-2人肾细胞中，敲除Prox1或HNF1B导致Cry1、Dbp、Nr1d1表达水平升高，但节律相位不变。RNA-seq分析显示，Prox1缺失导致约60%的振荡转录本失去节律性，其中BMAL1/PROX1共占据基因中58%受影响，而非节律基因的表达变化较小。这证明这些因子在组织特异性节律转录中发挥广泛作用。
讨论部分指出，CLOCK/BMAL1互作组组成受时间动态和组织特异性双重调控，组织特异性是主要决定因素。同源异型域因子可能作为“缓冲器”，通过抑制CLOCK/BMAL1的转录爆发来调节振幅，从而维持组织稳态。研究还发现，其他组织特异性转录因子可能通过类似机制与核心时钟互作，为理解普遍转录因子的上下文依赖活性提供了框架。研究结论强调，组织特异性蛋白互作是核心时钟实现组织特异性转录输出的机制，该互作组图谱为昼夜节律生物学提供了资源，并揭示了同源异型域因子作为时钟与组织身份之间的关键联系。
