预防胃食管反流病标志性特征——扩张的细胞间隙的基因治疗方法

《Gene Therapy》：A gene therapy approach to prevent dilated intercellular space, a hallmark of gastroesophageal reflux disease

　　

食管疾病（从胃食管反流病（GERD）到癌症）的发病率在过去10年中急剧上升，然而，针对食管的有效基因递送方法描述有限。研究人员开发了一种简单有效的基于电穿孔（electroporation）的基因递送程序，用于靶向活体动物的远端食管。研究人员利用这一方法预防了扩张的细胞间隙（Dilated Intercellular Space, DIS）的形成，DIS是GERD的病理特征，表现为紧密连接（tight junctions）破坏和上皮屏障功能丧失。研究人员发现，GERD患者活检组织中紧密连接蛋白和Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基（Na⁺,K⁺-ATPase β1 subunit）的表达水平降低。用表达Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基的质粒转染食管上皮细胞，可增加紧密连接蛋白水平和跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）。电穿孔介导的基因递送至远端食管在大鼠和兔模型中均未造成损伤，基因表达在2天内于食管黏膜中检测到，并持续至少12周。在兔GERD模型中，12周时出现DIS，而当递送Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基后，DIS减少了70%。这些结果对于未来开发基于基因的GERD及其下游后果的治疗方法具有鼓舞意义。

**论文解读：基因治疗预防胃食管反流病标志性特征——扩张的细胞间隙**

**研究背景与现存问题**

胃食管反流病（Gastroesophageal Reflux Disease, GERD）是一种影响美国及西方国家约三分之一成年人的常见疾病，以烧心、反酸等典型症状及哮喘、慢性咳嗽等食管外表现为主。慢性GERD患者进展为Barrett食管（Barrett’s Esophagus, BE）的终生风险为13%–20%，进而食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma, EAC）的发病风险增加11–40倍。尽管质子泵抑制剂（Proton Pump Inhibitors, PPIs）是目前最有效的治疗手段，但仍有高达45%的GERD患者对标准治疗无效（即难治性GERD），且过去20–30年间EAC的发病率在美国及其他西方国家增加了600%–700%。此外，PPIs的长期使用可导致慢性肾病、心肌梗死等严重副作用。因此，亟需开发新的治疗方法来应对PPI难治性GERD，并可能降低BE和EAC的发生。

扩张的细胞间隙（Dilated Intercellular Space, DIS）是GERD患者食管鳞状上皮的标志性病理特征。在反流疾病中，胃十二指肠内容物反流至远端食管，胆汁酸等成分通过损伤上皮和破坏细胞连接导致DIS形成及屏障功能丧失。研究表明，顶端连接复合体（Apical Junctional Complexes, AJC）中的多种蛋白（包括紧密连接、黏附连接和桥粒蛋白）在GERD患者的下食管鳞状上皮中丰度降低，与旁细胞通透性增加和DIS相关。屏障功能减弱和细胞间隙增宽使胆汁酸等反流成分持续浸润细胞，导致细胞损伤、炎症和组织修复，进而可能诱发BE和EAC。恢复组织屏障功能被认为是避免细胞损伤、炎症和异常修复的关键策略。

然而，目前尚无药物能特异性上调单个紧密连接或黏附连接基因或促进AJC形成与功能。基因治疗（Gene therapy）可能提供替代途径。研究人员在急性肺损伤的基因治疗研究中发现，Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基（Na⁺,K⁺-ATPase β1 subunit, β1）可增加肺中多种紧密连接和黏附连接蛋白的膜丰度及功能，并增强屏障功能。因此，研究人员试图将该基因递送至食管，探究其是否能在适当模型中减少DIS。但食管基因转移方法的进展甚微，仅有少数报道使用脂质体或腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV），但均未实现稳健的基因转移和表达。研究人员利用电穿孔（Electroporation）技术，该技术可有效将基因递送至组织的多个细胞层面而不损伤组织，此前已成功应用于肺和血管等器官。

**研究内容与结论**

本研究开发了一种基于电穿孔的简单有效的基因递送方法，靶向活体动物远端食管。研究人员利用该方法将Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基基因递送至食管，发现其过表达能增加顶端连接复合体蛋白的表达，并在兔GERD模型中减少DIS的形成。该研究首次证明了电穿孔介导的基因转移可在食管黏膜中实现高水平、持久的基因表达，且β1亚基的递送能有效预防GERD标志性病变DIS的发生，为开发GERD及其下游后果的基因治疗奠定了基础。论文发表在《Gene Therapy》。

**关键技术与方法**

研究人员主要采用以下关键技术：1）电穿孔介导的体内基因转移：通过手术暴露大鼠或兔的远端食管，将质粒DNA溶液（含pCMV或pUbC启动子驱动的报告基因或β1亚基基因）包裹食管，施加8个方波电脉冲（200 V/cm，10 ms，间隔1 s）进行转染。2）兔部分心肌切除术（partial cardiomyectomy）模型：去除远端食管约270°的肌层，诱导GERD样DIS病变。3）免疫荧光染色和Western blot检测AJC蛋白（如ZO-1、Occludin、Claudin-1,3,4,18、α-catenin、E-cadherin）及Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基的表达。4）透射电子显微镜（TEM）定量测量DIS宽度和细胞间隙面积。样本队列包括：从Rutgers大学医学院获取的5例正常对照、5例GERD、5例BE及5例EAC患者食管活检组织；大鼠（Sprague Dawley，雌性，200–300 g）和兔（新西兰白兔，雌性，2.5–4 kg）各5只/组。

**研究结果**

**1. 顶端连接复合体蛋白在GERD、BE和EAC患者中表达降低**
对正常个体和GERD患者食管活检组织进行免疫荧光染色，发现正常样本中ZO-1、Occludin、α-catenin和E-cadherin呈典型的“鸡笼网”样膜定位，而GERD患者中这四种蛋白的荧光强度显著降低，且ZO-1、Occludin和α-catenin的分布变为点状或核周，提示连接复合体解聚、内吞和降解；E-cadherin虽仍定位于膜，但水平下降。

**2. Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基在病变食管上皮中表达减少**
GERD患者活检组织中Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基及其相互作用蛋白MRCKα的水平均较正常对照显著降低。在EPC1食管上皮细胞中，通过慢病毒转导过表达GFP-β1融合蛋白，Western blot显示ZO-1、Occludin、Claudin-1,3,4,18的表达均增加；用表达β1的质粒转染EPC1单层细胞后，跨上皮电阻（TEER）升高，表明屏障功能增强。

**3. 建立食管电穿孔介导的基因转移技术**
在大鼠中，通过手术暴露远端食管，用管状电极包裹并施加电脉冲，递送pCMV-luc或pUbC-luc质粒。2天后检测到荧光素酶表达（11–110 pg/g湿重），免疫组化显示GFP表达遍布食管黏膜全层，包括基底细胞。使用UbC启动子时，基因表达在6周和12周仍可检测到，且水平与CMV启动子2天时相当或更高，表明持久表达。

**4. 基因递送Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基上调大鼠食管紧密连接蛋白**
将pCMV-GFP-β1电穿孔至大鼠食管，3天后Western blot检测发现β1亚基（内源性及GFP-β1融合蛋白）表达升高，同时Occludin和ZO-1水平在多数动物中显著增加，与体外结果一致。

**5. 电穿孔不影响兔GERD模型中DIS的形成**
在兔部分心肌切除术模型中，立即进行电穿孔递送pUbC-GFP质粒或仅进行手术（无DNA对照）。12周后TEM显示，单纯手术组和手术+电穿孔组的DIS宽度（约1.0 μm）较正常组（0.137 μm）显著增加，但两组间无差异，表明电穿孔和非治疗性质粒不干扰DIS形成。

**6. Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基的表达预防兔GERD模型中DIS的形成**
在心肌切除术后立即电穿孔递送pUbC-GFP-β1或pUbC-GFP。12周后，GFP对照组出现明显的DIS和基底细胞增殖，而β1组显著减轻。免疫荧光显示，β1组α-catenin、ZO-1和β1亚基的膜定位和荧光强度与正常组接近，而GFP对照组则降低。TEM定量显示，心肌切除术后DIS宽度增加1400%（0.065 μm→0.917 μm），β1治疗使DIS宽度减少70%（至0.278 μm）；细胞间隙面积减少87%（3.751→0.500）。这些数据明确表明β1亚基表达能有效预防DIS。

**讨论与结论**

研究讨论部分指出，GERD是一种常见疾病，约18%–28%的美国成年人受影响，尽管抗酸治疗广泛使用，仍有17%–45%的患者存在难治性症状，需开发替代疗法。将GERD比作橄榄球赛，胃酸是进攻方，食管黏膜是防守方，当前抗酸治疗主要削弱进攻，但缺乏加强防守（即修复食管黏膜屏障）的治疗策略。本研究创新性地提出通过增强食管鳞状黏膜屏障来提升防御能力。

基于此前在肺中的研究，研究人员将Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基的过表达应用于GERD模型。在GERD患者和兔模型中证实了DIS及多种连接蛋白的减少，以及β1亚基和MRCKα的降低。研究人员首次将电穿孔技术应用于食管黏膜，实现了高水平基因递送，并证明β1亚基基因转移能有效预防AJC蛋白下调并减少DIS。与之前使用脂质体或AAV的策略相比，电穿孔能将基因递送至上皮全层，包括基底细胞，从而实现持久表达（UbC启动子下至少12周），而其他方法仅局限于表层细胞或无法穿透角质层。

本研究存在两个局限性：一是基因转移方法为侵入性手术，需外科暴露下食管；二是实验为预防性而非治疗性，即基因递送与损伤同时进行。未来需开发非侵入性方法（如灌胃结合体表电极）以及验证β1亚基能否逆转已形成的DIS。基于此前肺损伤中β1可逆转屏障破坏的发现，β1很可能在食管中也具有治疗作用。

**研究结论**：本研究开发了一种基于电穿孔的基因递送方法，成功将Na⁺,K⁺-ATP酶β1亚基基因递送至活体食管，该基因的过表达能上调紧密连接和黏附连接蛋白，并在兔GERD模型中显著减少扩张的细胞间隙（DIS宽度减少70%，面积减少87%），为GERD的基因治疗提供了新策略，有望预防疾病进展至Barrett食管和食管腺癌。