综述：阿尔茨海默病两种核心血液生物标志物（β-淀粉样蛋白和Tau蛋白）光学检测方法的研究进展

《Biosensors》：Progress in Optical Methods for the Detection of Two Core Blood Biomarkers of Alzheimer’s Disease: Amyloid-Beta and Tau Proteins

　　

阿尔茨海默病（AD）是全球最常见的神经退行性疾病。早期诊断AD对于延缓疾病进展和改善患者生活质量至关重要。血液生物标志物，特别是β-淀粉样蛋白（Aβ）和Tau蛋白及其磷酸化亚型，具有采样方便、微创和重复性优异等优势。然而，血液中AD生物标志物的极低浓度对检测方法的灵敏度、特异性和抗干扰能力提出了严格要求。光学方法凭借其高灵敏度和选择性、快速响应以及小型化潜力等固有优势，为解决这些挑战提供了有前景的分析平台。本综述系统总结了用于检测两种核心AD血液生物标志物（Aβ和Tau）的光学方法的最新进展，涵盖比色法、荧光法、化学发光法、表面等离子体共振（SPR）和表面增强拉曼散射（SERS）等技术。研究人员讨论了这些方法的传感原理、设计策略和分析性能，并特别强调了不同的信号放大策略。此外，本文还提出了一些挑战和未来展望，主要关注单分子检测、灵敏度与稳定性不足、缺乏大规模临床队列验证以及标准化缺失。本综述旨在为研究人员合理开发高性能光学方法以实现AD早期诊断提供指导。

1. 引言

阿尔茨海默病（AD）作为痴呆症的主要原因，占所有痴呆症诊断的60-70%，已成为全球第七大死因。全球超过5500万人患有阿尔茨海默病和其他痴呆症，预计这一数字每二十年翻一番。相关医疗保健总成本已超过1.3万亿美元，预计十年内将达到2.8万亿美元。AD的病理变化通常在首次临床症状出现前15至20年开始。AD的标志性病理特征是β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集形成的老年斑和过度磷酸化Tau蛋白（p-Tau）沉积形成的神经原纤维缠结。在AD进展过程中，患者通常在65岁左右出现早期症状，特征为语言、感知、运动和执行功能进行性下降，并伴有短期记忆严重受损。随着疾病进展到中晚期，患者逐渐丧失阅读、写作、沟通和独立生活的能力，最终需要全天候护理。死亡通常由感染、肺炎或心脏骤停等并发症引起。当前AD诊断系统面临严峻挑战。在满足临床诊断标准之前，患者通常经历轻度认知障碍阶段，主要表现为抽象思维能力下降和记忆丧失。由于这些症状易被误认为是正常衰老或压力，许多轻度认知障碍患者最终被诊断为AD，此时神经元损伤大多不可逆。目前临床使用的神经影像学技术，如磁共振成像、计算机断层扫描和正电子发射断层扫描，可提供大脑结构和病理的重要信息，但价格昂贵、操作复杂、需要专用设施且存在辐射风险，不适合大规模筛查和神经退行性疾病的长期监测。脑脊液（CSF）中生物标志物的检测具有高准确性，但依赖于腰椎穿刺。这种侵入性手术患者接受度低，限制了其在无症状人群早期筛查中的应用。此外，正电子发射断层扫描和先进成像技术需要回旋加速器等专用设备，进一步限制了其在初级医疗保健环境中的应用。因此，开发能够实现微创采样、快速检测、低成本、高灵敏度和高特异性的早期AD诊断技术已成为神经疾病精准医学的核心科学问题。

AD的发病机制极其复杂，突出表现为蛋白质错误折叠和异常磷酸化、持续性神经炎症、突触丢失和神经元凋亡。其中，Aβ和Tau蛋白的异常聚集被认为是驱动AD发生和发展的核心机制。Aβ和Tau蛋白作为AD的两个核心生物标志物，其浓度在不同生物体液中差异巨大，对检测技术提出了重大挑战。传统方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA），缺乏量化外周血中超低丰度生物标志物的灵敏度，且不同试剂盒的结果需要标准化。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）具有高灵敏度，但操作复杂，需要专业人员，且样品预处理耗时，不适合神经退行性疾病的大规模筛查。具有高灵敏度和特异性的光学方法为克服这些瓶颈提供了可行的技术路径。它们可以区分Aβ单体与寡聚体，识别Tau蛋白上特定的磷酸化位点，并进行多指标的同时定量分析。近年来，基于贵金属（金和银）和半导体材料的传感器基底已被开发，通过电磁和化学增强的协同效应提高了检测性能。研究人员还开发了用于特异性识别和检测Aβ和Tau蛋白的等离激元纳米结构，具有低检测限。光学免疫传感器可以同时检测多个靶标和亚型（例如Aβ40/Aβ42、总Tau和p-Tau），从而能够在临床生物体液样本中直接可靠地区分AD患者和健康对照。

需要注意的是，血液中AD生物标志物的浓度极低（pg/mL甚至fg/mL水平），且不同生物标志物的分布存在显著重叠，易受年龄和肾功能等生物学因素影响。因此，单纯追求更低的检测限不足以支持临床决策，必须建立标准化的大规模人群数据库以实现动态纵向追踪。比色法具有操作简单、不依赖复杂仪器和成本效益高等优点，可实现快速可视化检测。此类方法适用于初级保健和社区环境中AD高危人群的初步筛查。基于金纳米颗粒（AuNPs）的侧流层析检测（LFA）试纸条是代表性例子，当与磁富集和机器学习优化结合时，其灵敏度可进一步提高。然而，其灵敏度相对较低（通常为pM至nM水平），难以满足对超低丰度生物标志物精确定量的要求。因此，比色法可用于不同人群的初步分诊筛查，而非独立的确认性诊断工具。荧光法具有高灵敏度（可达fg/mL水平）和快速响应，其性能可通过各种信号放大策略（如荧光共振能量转移（FRET）、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白（Cas）（CRISPR-Cas）系统和核酸扩增）进一步增强。它们可以实现核心AD血液生物标志物的准确定量，以支持临床诊断和严重程度评估。然而，相对复杂的操作和高昂的设备成本限制了其在大规模人群筛查中的适用性，它们主要适用于需要精确定量的临床场景。化学发光检测提供pg/mL水平的灵敏度且自动化程度高，适用于检测相对丰富的血液AD蛋白生物标志物。然而，在实际应用中，需要预先评估该方法是否能覆盖不同AD阶段的生物标志物浓度范围，以确保检测结果的可靠性。表面等离子体共振（SPR）是一种无标记实时检测技术，可以监测生物分子间的相互作用。其临床定位是在大型医疗中心进行确认性诊断和治疗监测，实现生物标志物的无标记实时定量检测，以支持AD诊断和疾病进展的动态监测。微型化局域表面等离子体共振（LSPR）芯片和光纤传感器为便携式检测提供了潜力。然而，SPR和LSPR仪器昂贵且通量有限，需要全面评估其检测不同AD阶段生物标志物浓度变化的能力。表面增强拉曼散射（SERS）方法结合了超高灵敏度（低至fg/mL甚至ag/mL水平）和“分子指纹”特异性，通过电磁场增强实现单分子水平检测，并支持单次测试中同时进行多靶标检测。然而，SERS仪器成本高昂且操作相对复杂，光谱重现性受基底批次间差异影响。目前，SERS主要用于大型医疗中心的确认性诊断和临床试验参与者筛选，而其在大规模筛查中的应用仍受标准化挑战的限制。

不同的光学方法在临床路径中各有其适用的场景和局限性。有效方法的开发应与实际应用需求相匹配。基于此认识，本文聚焦于用于定量分析AD两种主要血液生物标志物Aβ和Tau的光学传感技术的最新进展。研究人员系统总结了五种主要光学生物传感技术（包括比色法、荧光法、化学发光、SPR和SERS）的传感原理、设计策略和分析性能。特别强调了不同的信号读取和放大策略，例如酶/纳米酶催化的显色反应、聚集诱导的颜色变化、基于核酸的信号放大、基于抗体/适配体的无标记或夹心法测定，以及人工智能（AI）辅助分析。此外，还讨论了多生物标志物检测、微流控集成和单分子免疫测定等新兴方向，并介绍了当前面临的挑战，如灵敏度不足、缺乏临床验证和标准化缺失。本综述旨在为高性能光学方法的合理设计提供系统参考，并推动生物标志物检测从实验室研究向临床实践转化。

2. Aβ和Tau蛋白

Aβ是一种约4 kDa的肽或蛋白质，由β-分泌酶和γ-分泌酶依次水解淀粉样前体蛋白（APP）产生。Aβ最常见的亚型是Aβ1-40（或Aβ40）和Aβ1-42（或Aβ42），分别含有40和42个氨基酸残基。与Aβ40相比，Aβ42的疏水性增强，使其本质上更容易错误折叠并随后聚集。它可以依次形成可溶性寡聚体、不溶性原纤维，并最终沉积为老年斑。研究表明，可溶性Aβ寡聚体（AβO）是关键的毒性因子，可导致突触可塑性受损、长时程增强抑制和记忆缺陷。Tau是一种可溶性微管相关蛋白，分子量范围为55至62 kDa。它主要分布在神经元轴突中，维持细胞骨架的稳定性并促进微管组装。在生理条件下，Tau可通过磷酸化、糖基化和氧化修饰动态调节其与微管的结合。在AD中，异常过度磷酸化会诱导Tau从微管上脱离，聚集形成可溶性寡聚体，并进一步形成神经原纤维缠结，导致严重的神经毒性。此外，Aβ的沉积可直接触发Tau过度磷酸化，并通过Fyn激酶加剧谷氨酸能信号紊乱和钙稳态失衡，进一步加速病理进展。在众多磷酸化位点中，p-Tau181、p-Tau217和p-Tau231与AD病理学表现出最强的相关性。值得注意的是，这些磷酸化Tau种类的水平在早期甚至症状前阶段的外周生物体液中显著上调，显示出良好的AD诊断准确性。此外，其他亚型，包括p-Tau205和p-Tau212，也显示出区分AD与其他神经退行性疾病的强大潜力，并在疾病分期或联合诊断中具有潜力。

Aβ和Tau蛋白的浓度在CSF中最高，因为CSF可直接接触大脑的细胞外空间。例如，AD患者CSF中Aβ42的水平通常低于500 pg/mL，而健康个体约为800 pg/mL。AD患者总Tau的水平达到约850 pg/mL，约为健康对照的两倍。AD患者p-Tau181的水平约为95 pg/mL，而健康对照约为48 pg/mL。尽管CSF样本对AD诊断具有高诊断准确性，但腰椎穿刺的侵入性限制了其临床应用。相比之下，血浆样本可通过常规采血获得。然而，AD生物标志物必须穿过血脑屏障才能进入血液，导致浓度通常降至pg/mL甚至fg/mL水平。例如，AD患者血浆中Aβ42的水平可能降至20 pg/mL以下，p-Tau181的变化范围约为10-25 pg/mL。唾液和尿液可提供非侵入性样本采集。然而，唾液和尿液中生物标志物的浓度更低，个体差异大，稳定性差。例如，唾液中总Tau的水平通常在10-20 pg/mL范围内，健康个体和患者之间存在大量重叠，使得建立诊断临界值极为困难。

Aβ42/Aβ40以及不同亚型的p-Tau蛋白，如p-Tau217、p-Tau181和p-Tau231，已被证明是AD早期筛查的有效血液指标。在这些首选蛋白质生物标志物中，p-Tau217的水平以及Aβ42/Aβ40或p-Tau217/Aβ42的比值尤其被推荐为AD分期或预后最有价值的指标。对于混合型AD患者，应结合临床评估、神经影像学发现和其他非AD特异性生物标志物进行综合分析，以避免因核心AD生物标志物浓度非典型变化而导致的漏诊或误诊。

3. 光学方法

在新兴检测技术中，光学方法因其能够实现高效、特异性和微创的靶标检测而备受重视。它们在早期诊断和疾病进展实时监测中发挥关键作用，并表现出高灵敏度、低成本和低检测限。其中一些方法比电化学技术响应更快。例如，比色法和荧光检测可以通过测量颜色/荧光强度的变化实现快速简单的检测。通常，光学方法主要有两种检测类型：直接结合法和夹心法。直接结合法的信号来源于分析物-受体相互作用。相比之下，夹心法中通常使用信号标签产生相应的信号，这些信号可通过比色、荧光或发光技术测定。

3.1. 比色检测

比色检测因其成本效益高且无需复杂仪器的固有优势而备受青睐。根据传感元件的类型，比色检测可分为几种类型，包括适配体传感器、免疫测定和酶法，分别以适配体、抗体和酶作为受体。传统的比色方法通常涉及酶促显色系统。例如，辣根过氧化物酶（HRP）通常用于催化过氧化氢对3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的氧化，导致可观察到的颜色变化。与天然酶相比，纳米酶表现出更高的稳定性、更低的成本和相当的催化活性。此外，纳米材料已被用作比色检测中的信号指示剂或载体，极大地提高了检测灵敏度。纳米材料还可以用适配体、抗体或其他识别元件进行修饰，以表现出独特的物理、化学和光学特性。对于AD生物标志物的比色检测，传感策略主要包括酶或纳米酶介导的显色反应以及由纳米颗粒聚集或分散引起的SPR变化。通过这些机制，分子识别事件可以转化为可观察的颜色输出，从而实现对血液样本中AD生物标志物的直接、灵敏的检测。

通过显色反应，用于测定Aβ和Tau蛋白的酶和纳米酶主要包括HRP、脲酶、氯化血红素/G-四链体、DNAzyme、Au@Pt和Ni@Pt纳米酶、适配体模板化的DNA-Ag/Pt纳米簇以及多孔双金属ZnO-Co₃O₄纳米笼。基于显色反应检测不同目标物的分析性能如表1所示。一个突出的例子是Chen等人开发了一种用于检测AβO的通用模块化人工探针。该探针采用了适配体、DNAzyme和纳米酶的创新三组分设计。二氧化硅纳米颗粒（SiO₂ NPs）作为载体，用于共价固定AβO特异性适配体、DNAzyme和具有过氧化物酶（POD）样活性的碳量子点（CQDs）。特异性适配体-AβO识别反应诱导适配体构象变化以激活DNAzyme，导致随后底物裂解和大量CQDs的释放。释放的CQDs可催化过氧化氢将无色TMB氧化成蓝色产物，从而实现AβO的可视化检测。该策略已用于通过尿液检测进行AD早期诊断，其灵敏度比传统ELISA高67倍。体内多项评估证实了该方法区分AD模型小鼠与健康个体的良好生物相容性和可靠能力。这种模块化传感策略为AD早期诊断开辟了新的非侵入性方向。

具有合成寡核苷酸或肽作为受体以实现高特异性靶标识别的适配体传感器已被广泛开发用于AD生物标志物的检测。Chen等人制备了一种温度响应性pNIPAM-DNA水凝胶平台，用于比色检测低分子量可溶性β-淀粉样蛋白寡聚体（LSAβO）。该水凝胶通过温度控制下的可逆溶胀和收缩实现靶标富集，在与LSAβO特异性结合后触发G-四链体DNAzyme的形成。形成的DNAzyme催化TMB氧化产生可见颜色信号。得益于水凝胶的孔径筛分效应，该生物传感器有效排除了大的淀粉样蛋白聚集体和其他干扰物。其线性检测范围为0.1-7.5 nM，检测限为50 pM。通过人工和临床CSF样本验证，该方法显示出良好的准确性和重现性。该平台具有操作简单、成本低、检测时间短等优点，适用于高通量初步筛查和AD早期辅助诊断。然而，传统策略中识别元件和信号转导组件的固有分离可能会增加检测的复杂性和经济成本。一个能够同时实现识别、信号转导和内在放大的高度集成平台将代表即时诊断技术的决定性突破。基于此考虑，Fan等人合成了多种金属功能化的UiO-66-NH₂金属有机框架（MOF）纳米酶，发现负载铂的MOF表现出最佳的过氧化物酶样催化性能。然后基于Aβ42与MOF之间的竞争性结合建立了一种比色传感策略。该传感器具有良好的抗干扰能力，并能抑制Aβ肽的聚集。在纯溶液中检测Aβ42的检测限为2.76 nM，在稀释的CSF中为4.65 nM。由于其低成本和易于操作，该比色平台是实验室分析和床旁AD筛查的有前景的候选工具。

除了上述由天然或人工酶催化的显色反应外，比色分析的另一种策略基于分析物调节的纳米颗粒聚集。金和银纳米颗粒（AuNPs和AgNPs）由于其SPR效应而表现出独特的光学性质。当这些纳米颗粒在溶液中从分散状态转变为聚集状态时，会发生明显的颜色变化。特定的靶标分子（例如Aβ肽或Tau蛋白）可以调节纳米颗粒组装，从而实现无酶比色检测，包括抗体修饰的AuNPs或AgNPs、适配体功能化的AuNPs、Cu²⁺介导的AuNPs以及AuNPs功能化的微针。通常，Neely等人首次报道了使用单克隆抗Tau抗体包被的AuNPs进行Tau蛋白的比色检测。检测限为1 pg/mL，比CSF中Tau蛋白的临界值（195 pg/mL）低约两个数量级。此外，Deng等人开发了一种基于AuNPs的比色适配体传感器，用于检测低分子量可溶性Aβ40寡聚体（LS-Aβ40-O）。作为LS-Aβ40-O识别元件的靶标特异性适配体可吸附在AuNPs表面。使用高盐条件诱导适配体修饰的AuNPs聚集。纳米颗粒表面形成LS-Aβ40-O-适配体复合物增强了AuNPs的耐盐性。该方法在175 mM NaCl存在下显示出35~700 nM的线性范围，对LS-Aβ40-O的检测限为10 nM。它进一步被用于区分健康人和AD患者的CSF样本。然而，基于聚集的比色方法很少应用于血液中AD生物标志物的检测，这可能是由于其灵敏度低以及血液中未知成分的潜在干扰。

研究人员一直在探索集成检测方法和信号增强策略，以克服血液样本的复杂性并实现超低丰度生物标志物的可视化。侧流层析和基于纸基的光学免疫测定可以检测大多数核心AD生物标志物，并有望用于即时检测。基于AuNPs的侧流层析检测是目前最有前途的疾病快速诊断工具之一。Wang等人开发了一种超声增强、机器学习优化的比色流式检测平台，用于灵敏检测Tau蛋白。该方法实现了10.3 pg/mL的检测限、0.02-4 ng/mL的线性范围和约20分钟的总检测时间。该设备集成了一个便携式超声致动器，通过超声快速富集颗粒，这对于通过样品预富集提高灵敏度至关重要，随后进行机器学习辅助的分类和预测放大比色信号。在人血浆上的进一步即时检测证实了该流式检测方法的临床潜力。它能够有效分类和检测未稀释血清中的Tau，平均分类准确率达到98.11%，平均预测准确率达到99.99%。

3.2. 荧光检测

基于荧光的蛋白质检测平台具有众多优势，包括超高灵敏度、快速信号响应和相对简单的操作。荧光成像已引起研究人员的关注，以开发用于AD早期诊断的各种探针。许多综述聚焦于通过光诱导电子转移（PeT）、聚集诱导发射（AIE）、共振能量转移（RET）、内部电荷转移（ICT）等调控机制，利用小分子荧光探针对Aβ和Tau聚集体进行成像的不同设计策略，为未来新型诊断工具的开发铺平了道路。然而，血液中Aβ、Tau及其相关物种的皮摩尔或亚皮摩尔丰度远低于传统有机荧光探针的检测限，使得可靠定量极为困难。为了解决这一瓶颈并提高整体性能，主要采用了两种方法。第一种是升级荧光检测设备，使用大型或先进的光学系统来捕获微弱的荧光信号。第二种是开发先进的荧光方法和放大技术，以增强信号强度和稳定性，实现对AD相关血液生物标志物的超灵敏检测。鉴于复杂荧光设备昂贵、操作复杂且体积庞大，本节仅重点总结基于纳米探针工程和信号放大技术检测蛋白质生物标志物的最新研究。

使用荧光标记的识别元件来识别靶标并产生信号是一种传统的荧光检测技术。在这种方法中，荧光标签通常与生物识别元件结合，实现对Aβ、Tau和一系列其他AD相关生物标志物的定性和定量检测。该方法操作简单，允许直接光学读出，非常适合常规实验室分析。FRET效应源于非辐射能量转移。当供体-受体距离小于约10 nm时，供体的荧光将被受体猝灭。一旦距离超出此范围，FRET过程将被阻断，供体荧光将恢复。随着探针设计、纳米技术和信号转导机制的不断进步，各种荧光检测平台应运而生。近年来，基于FRET的荧光传感平台也被广泛开发用于检测AD蛋白生物标志物，其中纳米材料作为猝灭剂。此类方法通常包括两个步骤：将荧光标记的探针吸附到纳米猝灭剂表面导致荧光猝灭，以及靶标与探针结合恢复荧光。基于此原理，我们的团队实现了使用荧光标记的适配体或肽作为检测探针，以及卟啉取代的苯丙氨酸-苯丙氨酸纳米颗粒、聚多巴胺纳米球和氧化石墨烯作为纳米猝灭剂来检测AβO。更有趣的是，纳米猝灭剂可作为纳米药物抑制Aβ单体的聚集并溶解聚集体。此外，Liu等人开发了一种传感器阵列来监测CSF中的Tau蛋白，并阐明了镉离子暴露与AD中Tau病理聚集之间的相关性。合成了两种具有不同发光特性的氧化锌（ZnO）亚微米颗粒（SMPs），即发蓝光的B-ZnO和发红光的R-ZnO。研究人员研究了在紫外和可见光照射下，适配体修饰的B-ZnO和R-ZnO对不同Tau亚型的多种光谱响应。借助主成分分析（PCA），该传感器阵列独特的指纹图谱首次实现了对Tau381、Tau410和Tau441的同时定量。该生物传感器进一步应用于追踪镉离子暴露后AD大鼠CSF中Tau441/Tau381比值（Tau441%）的动态变化。

当与小型功能基团或金属物种结合后，传感材料可以被设计为表现出特定的识别和信号转导能力。这些特性使得AD生物标志物的检测简单、快速、高灵敏度和高选择性。例如，Abraham等人设计了一种无抗体纳米探针（L-Arg@PAA@LiYF₄:Yb,Tm）用于检测Tau蛋白。在980 nm激光激发下，合成的上转换纳米颗粒在480 nm处发射蓝色荧光。纳米颗粒进一步用带负电的聚丙烯酸进行表面功能化，其发射的上转换发光被带正电的L-精氨酸通过静电相互作用猝灭。Tau蛋白与L-精氨酸的胍基结合恢复了纳米探针的发光。该方法实现了5.01 pg/mL的检测限和49.18-477.7 pg/mL的线性范围。它对竞争蛋白和其他生物标志物具有良好的选择性，在人血清加标样品中的回收率为96-105%。此外，Xu等人开发了一种由三种修饰的聚酰胺树枝状大分子组成的荧光传感器阵列。该阵列以100%的准确率区分了各种蛋白质，证明了该设计的合理性。使用机器学习算法，该稳健的三元阵列能够在不同干扰物质、血清和CSF存在下并行检测多种Aβ40/Aβ42聚集体，可检测浓度为0.5 μM，显示出AD诊断的巨大潜力。

荧光探针易受背景干扰和光漂白的影响，并且传统的荧光方法通常缺乏足够的灵敏度来定量超低浓度的血液生物标志物。为了解决这些局限性，研究人员开发了先进的荧光纳米材料，并进一步将其与比率或荧光“开启-关闭-开启”检测模式相结合。这些策略显著增强了整体分析性能（例如灵敏度、稳定性和重现性），使其非常适合用于血液中AD生物标志物的可靠定量。例如，基于FRET的比率或荧光开关传感系统可以提供自校准并提高分析准确性，Li等人通过整合多价适配体、杂交链式反应（HCR）和CRISPR-Cas系统设计了一种超灵敏的荧光适配体传感器用于p-Tau181检测。由于信号放大、适配体高特异性和Cas优异的切割活性的协同效应，该生物传感器实现了宽线性范围（0.1-10⁶ pg/mL）和低检测限（0.069 pg/mL），并表现出高选择性和强抗干扰能力。它可以有效测定血清和人工CSF中的p-Tau181，显示出AD早期诊断的巨大前景。此外，Liu等人通过将邻近延伸测定（PEA）与PCR/RPA和CRISPR/Cas12a系统相结合，开发了一种用于p-Tau181荧光检测的灵敏方法。两个PEA探针与单个p-Tau181分子的结合触发了探针杂交和延伸，将蛋白质检测转化为可扩增的核酸检测。所得DNA通过PCR/RPA和Cas12a反式切割的信号放大进行定量。PEA-PCR-CRISPR/Cas和PEA-RPA-CRISPR/Cas系统分别实现了149 fM (6.8 pg/mL) 和45.4 fM (2.1 pg/mL) 的检测限。PEA-RPA-CRISPR/Cas测定在人血清中的准确性通过与商业ELISA试剂盒对比得到验证。

荧光免疫测定是一种在生物样本上进行的传感方法，用于检测任何生物标本或样本中的特定抗原，反之亦然。识别抗体可以用荧光染料、酶和量子点（QDs）进行标记，通过直接或夹心免疫反应作为替代染色程序进行信号读出。例如，Gagni等人通过用二甲基丙烯酰胺、3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的三元共聚物涂覆硅芯片，开发了一种高灵敏度的荧光免疫测定平台，用于检测人工CSF中73 pg/mL的Aβ42。Alishahi等人使用该技术成功检测了五种AD血液生物标志物（Aβ40、Aβ42、p-Tau、NfL、GFAP），展示了多重检测的优势。然而，这些方法存在一些明显的局限性，例如灵敏度不足以准确定量低丰度生物标志物、自动化程度低和反应时间长，限制了其临床筛查应用。此外，它们涉及多个检测步骤，包括洗涤、分离、孵育和荧光检测或成像。

最近，研究人员开发了各种技术，通过将荧光免疫测定与磁分离和流式细胞术相结合来提高检测灵敏度。靶蛋白可以通过抗体包被的板、微球或磁珠捕获。这些方法提供高通量、多参数同时检测，为开发AD生物标志物的多重检测提供了重要的技术支持。DNA扩增是指复制特定DNA序列以增加其拷贝数。DNA扩增技术已与荧光免疫测定相结合，显著提高了检测灵敏度和效率，包括滚环扩增（RCA）、聚合酶链式反应（PCR）、引物交换反应和CRISPR/Cas系统。通常，Hu等人开发了一种免疫磁性外泌体聚合酶链式反应（iMEP）平台，用于快速检测人血液外泌体中的Aβ（Aβ40、Aβ42）和磷酸化Tau（p-Tau396,404、p-Tau181）。在这项研究中，使用立足点介导的DNA链置换来纯化和富集DNA-抗体缀合物。结合夹心ELISA的高特异性和PCR的信号放大能力，iMEP平台可以轻松测定浓度低至10 fg/mL的靶标。该方法能够选择性识别血液外泌体中的多种AD相关生物标志物，并通过测量靶标水平以95%的灵敏度和特异性区分临床诊断的AD患者和健康个体。此外，Xu等人通过将滴状多孔微流控芯片与RCA免疫磁珠相结合，报道了一种用于血清外泌体中Aβ42和p-Tau181定量分析的灵敏系统。该方法实现了飞摩尔检测限，优于传统超速离心方法，实现了AD的无创早期诊断。良好的灵敏度和特异性使其能够区分临床前阶段的患者。Guo等人开发了一种基于CRISPR/Cas系统的数字分析平台，命名为CRISPR-AD，用于同时检测外周血中的AD相关蛋白和microRNA。基于Cas12a和Cas13a的附带切割活性进行级联信号放大，该平台实现了极低的检测限（p-Tau217为60 fg/mL，miRNA-34a为0.5 fM）。使用AD患者、轻度认知障碍受试者和健康对照的血浆样本进行的临床验证证实，双生物标志物的联合检测显著提高了诊断准确性。作者进一步整合了智能手机成像和深度学习算法，构建了一个便携式检测模块。该技术在现场检测和AD早期筛查方面具有巨大潜力。

3.3. 化学发光检测

化学发光是指由特定化学反应或电子从激发态跃迁回基态产生的光发射。该技术是检测生物标志物的有效工具，具有无需外部光源、线性范围宽、精度高等优点。它还具有自动化程度高、高通量、快速响应和成本低的特点。化学发光探针可以通过调整其分子结构和基团，设计成在不同波长下发射光，用于对Aβ种类进行成像。化学发光探针的主要类别包括二氧杂环丁烷、鲁米诺、草酸盐、光泽精和吖啶衍生物，这些已在先前的综述中进行了很好的总结。化学发光成像的临床转化可以使用临床实践中已有的荧光成像仪器和工作流程进行。尽管如此，与荧光相比，化学发光成像在神经科学中的应用仍然有限，主要是因为其发光依赖于涉及活性氧的特定化学反应，并且大多数化学发光骨架具有固有的局限性，如脑渗透性差、波长可调性有限和稳定性不足。

化学发光免疫测定可以提供比ELISA更灵敏的过程。它特别适用于检测浓度超过50 pg/mL的多种蛋白质生物标志物。尽管有一系列商业可用的AD相关蛋白生物标志物化学发光检测试剂盒，包括Aβ40、Aβ42、p-Tau、神经丝轻链（NfL）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP），但临床评估数据显示，其检测阳性率低于临床诊断或Aβ-PET/Tau-PET。主要原因可能是检测灵敏度不足，难以区分病理条件下的细微浓度变化。此外，参考人群中混合型AD患者比例高可能影响检测特异性。基于此观点，研究人员开发了各种信号放大策略来提高化学发光免疫测定的灵敏度，例如酶、滚环扩增和信号分子负载载体。通常，Guo及其同事设计了一种增强的化学发光免疫测定，通过将吖啶酯与Ficoll400-链霉亲和素大分子扩增载体结合，用于定量分析血浆Aβ1-42。优化后的系统发光强度提高了35倍，检测限为0.15 pg/mL，定量限为0.31 pg/mL。该方法表现出优异的特异性、精密度和稳定性。对实际血浆样本的检测结果与商业临床试剂盒的结果高度一致。作为一种自动化分析方法，该生物传感器的性能优于许多传统检测方法，非常适合AD生物标志物的临床检测。

3.4. SPR生物传感器

SPR是最重要的光学传感技术之一，已广泛应用于各个领域。它通常可以监测分析物在金涂层传感器表面触发的折射率变化。该技术对识别分子相互作用高度敏感，检测范围覆盖长金膜区域（约200 nm）。SPR生物传感器具有低成本和高选择性的特点，并具有进行现场分析的能力。然而，常见的AD蛋白生物标志物分子量在几千到几万道尔顿之间，通过直接检测模型将引起相对较小的SPR折射率变化。基于AuNPs的SPR生物传感器表现出优异的光学性能，包括增强的信号放大能力、与有机化合物的良好相容性和高抗氧化性。AuNPs的尺寸和形状对SPR生物传感器的性能至关重要。例如，尺寸小于2 nm的AuNPs不适合制造SPR生物传感器，因为特定波长的光可能会干扰纳米颗粒表面的电子振荡。Tang等人提出了一种温和的生物固定化策略，通过结合SpyTag-SpyCatcher相互作用与细菌S层蛋白，在金传感表面构建有序的二维蛋白质纳米阵列，用于生物标志物检测。这种固定化方法可以保持固定化蛋白质的天然构象和生物活性，克服了传统化学交联引起的蛋白质变性和无序排列的缺陷。SPR结果表明，与化学交联相比，该方法将检测灵敏度提高了八倍，并且对于在化学反应条件下不稳定的蛋白质效果良好。通过猪瘟血清样本的血清学检测验证了纳米阵列的实用性。该方法可扩展到构建用于开发各种金基免疫传感器的生物传感界面。此外，为了提高直接检测的灵敏度，Zhao及其同事设计了一种基于Ag/Al₂O₃双曲超材料（HMMs）的SPR生物传感器，其中采用遗传算法对多个结构参数进行全局优化。得益于HMMs的体等离激元极化模式，该生物传感器产生了强烈的局域电场增强，折射率灵敏度达到43.62 μm/RIU，比传统SPR器件高一个数量级。该方法对Aβ42的检测限为0.18 pg/mL。此外，GA优化的HMM-SPR生物传感器在血清基质中表现良好，表现出优异的传感性能和良好的抗干扰能力，显示出在AD生物标志物高灵敏检测和筛查中的应用潜力。

在夹心检测模型中，SPR信号可以通过纳米材料和大生物分子因其独特的光学特性和大体积而被放大。例如，研究人员发现抗体可用作SPR标签，实现Aβ40和Aβ42的信号放大检测，因为抗体的分子量（约150 kDa）大约是两种Aβ单体分子量的35倍。Kim等人报道了两种基于适配体/抗体识别系统的夹心SPR生物传感器，用于检测α-1抗胰蛋白酶和Tau蛋白。对于Tau的检测，使用抗Tau抗体识别靶标，该靶标被金芯片上修饰的DNA适配体特异性捕获。该方法成功测量了AD患者血清样本中的Tau，检测限为50 fM。在这项工作中，适配体通过酰化反应固定在用巯基十一烷酸（MUA）和巯基化聚乙二醇（PEG-SH）修饰的金芯片上，并使用抗体作为信号放大器。此外，研究人员开发了与多通道微流控集成的超高倾斜光纤布拉格光栅（TFBG）-SPR传感平台，实现了对多种AD生物标志物的同时灵敏检测。CSF中不同形式的Aβ42已被原位测定并平行区分，检测限在30-170 pg/mL范围内。

LSPR是一种SPR现象，其特点是反射光的强度和角度随薄膜性质而变化。贵金属纳米颗粒广泛用于LSPR技术，因为其表面可以产生强电磁场，从而在纳米尺度上检测生物分子。基于此原理，研究人员设计了LSPR生物传感器，其中等离激元纳米颗粒中的电子被光激发。对不同尺寸金属纳米结构的比较表明，200 nm结构比100 nm结构具有更高的灵敏度。这是因为更大的结构更有效地利用折射率变化来放大信号并产生更强的局域电磁场。这种强烈的近场效应将使传感器能够以高灵敏度检测特定的抗原-抗体结合，在很大程度上不受血液中折射率变化或非特异性干扰的影响。Kim等人开发了一种使用球形、短棒和长棒AuNPs的形状编码LSPR检测平台。为了制造LSPR芯片，将AuNPs悬浮液在APTES包被的玻璃表面上孵育。PEG修饰的AuNPs和纳米棒通过EDC/NHS激活与抗Aβ和抗Tau单克隆抗体结合。该生物传感器可以检测模拟血液中的Aβ40、Aβ42和Tau，检测限分别为34.9 fM、26 fM和23.6 fM。此外，使用盐酸胍作为离液剂来克服基于血液的LSPR检测中的局限性。尽管